两种新型荧光黏度探针的合成及光学性质研究

王慧，胡磊，于坤，沈舒婷，崔光伟，谷晓霞，吴运军

(皖南医学院 药学院，安徽 芜湖 241002)

近年来，小分子荧光探针因其选择性好、灵敏度高、操作简便等优势，已经被广泛用于生命科学领域，比如生物体内分析物的检测(活性氧、金属离子、蛋白质等)、亚细胞器和组织成像及生物体内微环境的检测(极性、pH、黏度等)等[1-4].在生物体内，各种信号的传输和分子间的相互作用通常是由黏度控制的.当体内的黏度含量异常时可引发各种疾病，如老年痴呆症、糖尿病、动脉粥样硬化和癌症等[5-8].因此，检测细胞内微环境的黏度及其含量的变化具有重要的科学意义.但传统的检测方法(如旋转黏度计)无法实现对细胞内黏度的检测，通过科研工作者的不断摸索，利用具有较好生物相容性的小分子荧光探针可实现对细胞内黏度的检测，并可实时高效地观察细胞内黏度的变化情况.例如，2019年，刘志洪课题组报道了一种靶向线粒体黏度的近红外荧光探针4-((1E,3E)-4-(4-(二甲氨基)苯基) 1,3-丁二烯)-1-甲基喹啉-1-甲基碘盐 (NI-VIS)，该探针已成功应于观察肝硬化组织中黏度的变化情况[9]；2020年，林伟英研究小组开发了一种用于监测微黏度变化的双光子荧光探针(E)-2-(苯并噻唑-2-烃基)-3-(4-(9-乙基-9-咔唑-3-烃基)苯基)氰乙烯(CB-V)，该探针实现了对活细胞、斑马鱼和小鼠体内黏度的变化检测[10].

目前广泛应用的荧光黏度探针的设计原理是通过分子平面化、扭转的分子内电荷转移(TICT)和荧光共振能量转移(FRET)等机制来改变探针的发射强度，其中含有强给电子体(D)和强吸电子体(A)的TICT分子通常具有D-π-A分子结构[11].在此基础上，本文以吲哚为电子给体(D)，以喹啉盐和苯并噻唑盐为电子受体(A)，设计合成了两种D-π-A构型的黏度荧光探针(L1和L2) (如图1所示).在分子中引入磺酸盐和丁基官能团可提高分子的生物相容性；苯并噻唑盐和喹啉盐基团的引入能影响整个分子电子离域的程度.研究结果表明，探针L1和L2的荧光强度随溶液黏度的增加而增大.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

主要试剂：吲哚-3-甲醛(97%)，溴代正丁烷(98%)，2-甲基苯并噻唑(96%)，2-甲基喹啉(98%)，1,3-丙磺酸内酯(99%)均购自阿拉丁试剂有限公司，实验用水为去离子水.

主要仪器:Bruker Avance 400 核磁共振仪(瑞士布鲁克公司，室温，TMS为内标)；UV-5900 PC紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)；HITACHI F-4600 荧光分光度计(日本日立公司)；FinniganLCQ型质谱仪(美国赛默飞公司)；Leica TCS SP8激光扫描共聚焦显微成像系统(德国徕卡公司)；Infinite 2000pro型酶标仪(瑞士Tecan公司).

1.2 中间体M1的合成[12]

称取吲哚-3-甲醛(14.5 g,100 mmol)和50 mL DMF放入250 mL圆底烧瓶中，然后加入氢化钠(2.88 g，120 mmol)，室温下搅拌30 min，缓慢滴加溴代正丁烷(16.4 g，120 mmol)，70 ℃下反应12 h，反应结束后，冷却至室温，倒入大量冰水中，用稀盐酸调pH至7,有固体析出，减压抽滤，用水和乙醚洗涤2次，粗产物用乙醇重结晶，得淡黄色固体1-丁基-吲哚-3-甲醛M1.

1.3 中间体M2的合成[13]

在100 mL圆底烧瓶中，依次加入2-甲基苯并噻唑(9.29 g,62.3 mmol)，1,3-丙磺酸内酯(11.41 g，93.5 mmol)和30 mL甲苯，110 ℃下反应24 h，冷却至室温后有固体析出，减压抽滤，用乙醚洗涤2次，得白色固体3-(2-甲基苯并噻唑)丙烷-1-磺酸盐M2.

1.4 中间体M3的合成[11]

将2-甲基喹啉(8.92 g,62.3 mmol)，1,3-丙磺酸内酯(11.41 g，93.5 mmol)和30 mL甲苯依次放入100 mL圆底烧瓶中，110 ℃下反应24 h，冷却至室温后有固体析出，减压抽滤，用乙醚洗涤2次，得淡紫色固体3-(2-甲基喹啉) 丙烷-1-磺酸盐M3.

1.5 探针L1的合成

在100 mL圆底烧瓶中，依次加入M1 (0.76 g,3.8 mmol)和M2(1.05 g,3.9 mmol)，用35 mL乙腈完全溶解，滴加60 μL哌啶作为催化剂，回流24 h，冷却至室温，有固体析出，减压抽滤后粗产物用乙腈重结晶，得红色固体 1.09 g.产率：63%.1H NMR (d6-DMSO,400 MHz) δ:0.86-0.91 (t,3H),1.24-1.30 (m,2H),1.79-1.84 (m,2H),2.14-2.19 (m,2H),2.63-2.67 (m,2H),4.26-4.31 (m,2H),4.95-4.99 (m,2H),7.30-7.34 (m,2H),7.66-7.74 (m,4H),8.22-8.38 (m,4H),8.54-8.60 (m,1H).MS:理论值：454.1385；实验值：455.1449 [M+H]+.

1.6 探针L2的合成

称取M1(0.76 g,3.8 mmol)和M3 (1.03 g,3.9 mmol)放入100 mL圆底烧瓶中，用30 mL乙腈使其完全溶解，滴加60 μL哌啶，回流20 h，有固体析出，减压抽滤，粗产物用乙腈重结晶，得深红色固体 1.33 g.产率：78%.1H NMR (d6-DMSO,400 MHz) δ:0.85-0.87 (t,3H),1.45-1.47 (m,4H),1.89-1.91 (m,2H),228-2.31 (m,2H),4.30-4.32 (m,2H),5.32-5.34 (m,2H),7.32-7.33 (m,2H),7.67-7.68 (m,1H),7.81-7.83 (m,1H),7.89-7.92 (d,1H),8.05-8.07 (m,1H),8.22 -8.24(m,2H),8.51-8.53 (d,1H),8.70 - 8.79 (m,3H),8.99 (s,1H).MS:理论值：448.1821；实验值：449.1878 [M+H]+.

1.7 光学性质测试

用二甲基亚砜溶剂将探针L1和L2配成浓度为1×10-3mol/L的母液.

干扰实验：选择牛血清白蛋白(BSA)、小牛胸腺DNA、 L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、 L-丙氨酸、 L-谷氨酸、 L-色氨酸、L-丝氨酸、焦磷酸钠(ppi)、 RNA作为各种分析物来源，用去离子水定容，其中BSA、DNA、RNA的浓度为5 mg/mL，其余分析物的浓度为1×10-2mol/L.在测试过程中，用移液枪移取50 μL的探针溶液，置于5 mL的容量瓶中，然后分别加入200 μL的各种分析物，用磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.40)定容至5 mL.

溶剂化效应和黏度响应实验：选择苯(Benzene)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯(EA)、乙醇(EtOH)、乙腈(CH3CN)、DMSO、不同体积分数的水和甘油的混合溶液(水/甘油：0%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，99%)作为溶剂.用移液枪移取50 μL的探针溶液，置于5 mL的容量瓶中，然后分别用上述溶液定容至5 mL.

在所有的紫外吸收和荧光光谱测试中，探针L1和L2的浓度为10 μmol/L.荧光光谱的测试条件：探针L1,激发波长为470 nm，狭缝宽度均为5.0 nm，电压为500 V;探针L2,激发波长为480 nm，狭缝宽度均为5.0 nm，电压为500 V.

1.8 细胞毒性与细胞成像

细胞毒性：细胞毒性利用MTT方法进行测试，具体实验过程如下：待人肝癌细胞(HepG2)生长至对数期，将其种于96孔板，每孔体积100 μL，当细胞密度长至85%左右时，移去孔中培养基，加入含有不同浓度探针L1-L2 (5,10,20,25,30 μmol/L)的培养基溶液，每孔设三组平行实验，并设置调零组和对照组.共培养24 h后，每孔加入MTT溶液(10 mg/mL用PBS配制) 10 μL，继续孵育4 h.终止培养，小心弃除孔内培养基，每孔加入DMSO溶液100 μL，振荡15 min，用酶标仪测定590 nm处各孔的吸光值，根据细胞存活率的公式：细胞存活率=(实验组OD-调零组OD)/(对照组OD-调零组OD).

细胞成像：将人肝癌细胞(HepG2)种于4个激光共聚焦小皿中，待皿内细胞密度长至60%左右时，移去孔中的培养基，并设置以下两组实验：(1) 在2个小皿中分别加入含有10 μmol/L探针L1/L2 的新鲜培养基(1 mL)，与HepG2细胞共培养30 min；(2) 在另外2个小皿中分别加入含有10 μmol/L制霉菌素的新鲜培养基(1 mL)，与HepG2细胞共培养1 h，然后分别加入探针L1/L2 (10 μmol/L)继续培养30 min.培养好的细胞用PBS洗涤3遍，最后用激光共聚焦显微镜进行细胞成像.

图1 探针L1和L2的合成路线图

图2 探针L1和L2在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱及荧光光谱 (c = 10 μmol/L)

2 结果与讨论

2.1 探针的光物理性质

图2是探针L1和L2在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱和荧光光谱.从图2中可以看出，随着溶剂极性的增加，探针L1和L2的最大吸收峰位置发生明显的蓝移，但其最大发射峰位置基本不变，可能是因为基态溶质分子在溶液中与溶剂分子相互作用后的能级位置比激发态与溶剂分子作用的能级降低得多，虽然激发态的偶极矩大于基态的偶极矩，在荧光光谱上会表现一定的红移，但体系中因两种影响因素的同时存在(吸收带蓝移)，使位移发生部分抵消，从而导致溶剂对荧光峰位置的影响只有较小程度的改变[14].由图2可知，探针L1和L2在苯、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、乙腈和DMSO中的λmax分别为527/538 nm、505/525 nm、505/550 nm、486/508 nm、478/483 nm和480/499 nm，由此可以看出，探针L2在各个溶剂中的最大吸收峰位置相比于L1发生了明显的红移，可能是喹啉骨架相比较于苯并噻吩结构单元其共轭性更强，有利于分子内电荷转移.

2.2 探针对黏度响应的性质测试

为了探讨黏度与荧光强度之间的关系，在不同体积分数甘油/水黏性介质中，测试了探针L1和L2的荧光光谱，实验结果见图3A，随着甘油比例的增加，探针L1和L2的荧光强度显著增强.将溶剂从水变成99%的甘油体系时，探针L1在λmax= 531 nm处的荧光强度增强50倍，探针L2在λmax= 571 nm处的荧光强度增强131倍.造成这种现象的原因可能是黏性介质限制了分子内连接烯烃双键与芳环的单键的自由旋转，增加了整个探针分子的平面性，减少了非辐射跃迁的概率，因而探针的荧光强度增强[15]；而且探针L2的荧光增强倍数比L1高，可归根于L2中的喹啉结构单元比L1中的苯并噻唑基团具有更好的平面性，当分子中的单键扭转受到限制时，更有利于分子内电荷的流动.此外，我们发现，随着溶液黏度逐渐增加，探针L1和L2的荧光强度的对数(logI)与黏度的对数(log(viscosity))之间的关系遵循Förster-Hoffman定律[16](探针L1：R2=0.99，斜率=0.55；探针L2：R2=0.98，斜率=0.81) (图3B)，表明探针L1-L2可以对黏度进行定量检测.一般情况下，溶剂的极性对化合物的量子产率有一定程度的影响，以荧光素为参比，计算了探针L1和L2在不同溶剂中的荧光量子产率，如图3C所示,探针L1和L2在低黏度溶液中的量子产率很小，可忽略极性对探针的影响，这对其作为黏度探针检测环境黏度至关重要.

图3 (A)探针L1和L2在不同体积分数水/甘油黏性介质中的荧光发射光谱(c = 10 μmol/L)(插图为紫外灯365 nm照射下探针在水(左)和甘油(右)中的荧光);(B) 探针的荧光强度logI和溶液黏度的对数log(viscosity)之间的线性关系;(C) 探针L1和L2在不同溶剂中的量子产率,1.苯;2.四氢呋喃;3.乙酸乙酯;4.乙醇;5.乙腈;6.DMSO;7.PBS;8.10%甘油;9.20%甘油;10.30%甘油;11.40%甘油;12.50%甘油;13.60%甘油;14.70%甘油;15.80%甘油;16.90%甘油;17.99%甘油.

注：其中I为探针溶液与各种分析物作用后的荧光强度，I0为探针在PBS溶液中的荧光强度.1.BSA;2.DNA;3.L-半胱氨酸;4.L-苯丙氨酸;5.L-丙氨酸;6.L-谷氨酸;7.L-色氨酸;8.L-丝氨酸;9.ppi;10.RNA;11.99%甘油.图4 探针L1和L2在不同分析物和甘油中的荧光柱状图

由于细胞内含有很多生物大分子(DNA、RNA和BSA等)和氨基酸，为了进一步研究探针L1和L2是否能在复杂的细胞环境中表现出对黏度的专一性，测试了探针L1和L2与不同分析物作用后的荧光测试，如图4所示，在多种分析物存在下，探针L1和L2的荧光强度只发生微小的变化，而在99%甘油体系中，探针L1和L2的荧光强度明显增强，说明探针在复杂的细胞环境中能专一性响应黏度.

2.3 生物学应用

对于荧光探针在生物方面的应用来说，高的细胞存活率是必不可少的.在进行细胞显影之前，利用MTT方法测试了探针L1和L2的细胞毒性.从图5中可以看出，当探针与细胞作用24 h后，细胞的存活率均在80%以上，说明探针L1和L2具有低的细胞毒性，可将其安全地应用于细胞成像.

根据文献报道[17-18]，制霉菌素作为一种离子载体，可诱导细胞内部的结构改变或使其发生肿胀，使细胞内的线粒体黏度增加，因此，利用制霉菌素刺激细胞观察刺激前后探针在细胞内荧光强度的变化，实验结果如图6所示，当仅用探针L1和L2孵育的HepG2细胞中只展现出微弱的荧光，当用制霉菌素刺激1 h后，再分别用探针L1和L2与HepG2细胞共培养，细胞内的荧光强度明显增强，表明探针L1和L2可作为荧光黏度探针用于活细胞成像.

图5 不同浓度的探针L1和L2对HepG2 细胞的毒性测试

图6 探针L1和L2与用制霉菌素处理前后的HepG2 细胞中的激光共聚焦成像图.

3 结 论

以吲哚-3-甲醛为母体设计合成了两种新型的D-π-A构型的荧光黏度探针(L1-L2).随着溶液黏度的增加，探针L1和L2的荧光强度分别增强了约50倍和131倍，而且探针的荧光强度的对数与黏度的对数具有较好的线性关系.生物学实验表明探针L1和L2具有较低的生物毒性，在制霉菌素处理后的HepG2细胞中展现出较强的荧光.