玫瑰茄多糖对HeLa细胞凋亡相关蛋白的影响

王家豪 陈 晨 王冰烃 郑大恒

(绍兴文理学院 生命科学学院，浙江 绍兴 312000)

多糖(Polysaccharides)又被称作多聚糖，是由10个或10个以上的单糖通过糖苷键连接而成的高分子化合物，其相对分子质量为数万至数百万[1].多糖广泛存在于生物体中，是生物体内重要的生物大分子，广泛参与细胞增殖、细胞分化、细胞迁移以及细胞的信号识别和传导等[2].多糖在自然界分布极广，存在于动物、植物及微生物体内[3]， 具有抗氧化、 抗肿瘤等多种生物活性[4].

玫瑰茄(HibiscussabdazifaL.)又名山茄、洛神花、洛神葵，属锦葵科木槿属一年生药食同源植物，玫瑰茄中含有多糖、黄酮、多酚、花色苷等多种成分[5]，具有抗炎[6]、抗高血压、调血脂等多种药理作用[7].多糖作为玫瑰茄中重要的生物成分，研究表明具有提高机体免疫力的功效[8]，然而关于玫瑰茄多糖是否具有抗肿瘤活性少有报道.

宫颈癌作为最为常见的妇科恶性肿瘤之一，其全球死亡率仅次于乳腺癌，位于全球第二.HeLa细胞作为研究宫颈癌的模式细胞，研究表明植物多糖可以诱导HeLa细胞凋亡[9-10]，然而玫瑰茄多糖是否能引起HeLa细胞凋亡未见报道.因此，本研究选择HeLa细胞，探究玫瑰茄多糖对其诱导凋亡的作用.

1 材料与方法

1.1 材料

玫瑰茄，购自东莞市巴科医药科技有限公司；HeLa细胞，购自中国科学院上海细胞研究所；MTT细胞增殖检测试剂盒、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Bio-Rad生物有限公司；蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒以及Western Blot试剂盒，购自碧云天生物有限公司；Bax、Bcl-2、pro-Caspase-3、Caspase-3和二抗β-actin购于美国BBI公司；其余试剂均为国药集团分析纯试剂.

1.2 方法

1.2.1 玫瑰茄多糖的制备与纯化

采用水提醇沉法制备玫瑰茄粗多糖，具体如下：定量称取干燥玫瑰茄粉末，置于洁净干燥的500 mL圆底烧瓶中，按1∶25料液比，95 ℃水浴温度，浸提3 h.冷却后将所得水提液抽滤去除杂质，合并上清液，减压浓缩，将浓缩后的上清液加入烧杯中，缓慢加入95%乙醇(边加边用玻璃棒顺时针搅拌)至乙醇的最终浓度为80%，充分搅拌后放入4 ℃冰箱静置过夜，4 000 rpm离心10 min，收集沉淀用双蒸水复溶后挥醇，加15%三氯乙酸除去蛋白，用0.1 M NaOH调pH 7.0后装入透析袋，流水透析48 h，蒸馏水透析24 h，冷冻干燥后得到玫瑰茄粗多糖.将制备好的粗多糖采用DEAE-52纤维素交换树脂法纯化，以ddH2O洗脱控制流速为1 min/mL，采用硫酸-苯酚法进行糖含量测定，收集水洗多糖组分，冷却干燥后得到玫瑰茄纯化多糖.

1.2.2 细胞的培养

取HeLa细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养.当贴壁细胞数量达到80%～90%时，无菌条件下，弃去原培养液，用PBS溶液清洗两次，然后加入胰蛋白酶1 mL消化1 min弃去，加入含10%FBS的DMEM培养液，用移液枪吹打贴壁的细胞，当细胞成为均匀的单细胞悬液后，停止吹打，将细胞悬液按1∶3比例转移至新的细胞培养皿中，加入培养液，放于培养箱中培养.

1.2.3 玫瑰茄多糖对HeLa细胞增殖的影响

取玫瑰茄多糖至离心管中，放入超净台，在离心管中加入不含FBS的DMEM培养液配置浓度为4 mg/mL的多糖溶液，上下摇晃至多糖溶解，过滤至无菌，加入10%的胎牛血清，然后用含10% FBS的DMEM培养液稀释玫瑰茄多糖至终浓度为3 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL和0.5 mg/mL.

取对数生长期的HeLa细胞，制成悬液后计数，用含FBS的DMEM培养液调整细胞浓度为2×105个/mL，接种于96孔板上，每孔100 μL.培养24 h弃去原培养液，分别加入100 μL含玫瑰茄多糖的培养液， 使玫瑰茄多糖的浓度分别为4 mg/mL、3 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL，以不加玫瑰茄多糖的培养液生长的细胞作为阴性对照，每个组别设置5个复孔.培养48 h后，弃去原有培养液加入100 μL MTT试剂，培养4 h，弃去上清液，每孔加入100 μL DMSO放置摇床振荡1 h 后，于570 nm下测定吸光度，并按公式细胞抑制率(%)=(A1-A2)/A1×100%计算其抑制率，其中，A1表示空白对照组细胞的OD值的平均值；A2表示加玫瑰茄多糖组的细胞OD值的平均值.

1.2.4 HeLa细胞凋亡相关蛋白表达的检测

取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞浓度为5×105个/mL接种于6孔板培养24 h，分别加入4 mg/mL和1 mg/mL的玫瑰茄多糖的培养液作为高剂量组和低剂量组，同时不添加玫瑰茄多糖的正常对照组作为空白对照，培养24 h，按蛋白提取试剂盒制备细胞浆蛋白，BCA试剂检法测定蛋白浓度，采用western-blot法[11]检测细胞浆蛋白中Bax、Bcl-2、pro-Caspase-3和Caspase-3的表达量，采用Quantity One软件分析目标蛋白的灰度.

1.3 统计与分析

数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析，结果均用Mean±SD表示，采用ANOVA进行方差分析，P<0.05被认为有显著性差异，具有统计学意义.

2 结果和分析

2.1 玫瑰茄多糖的制备

通过水提醇沉法和DEAE-52纤维素离子交换柱制备玫瑰茄纯化多糖.采用硫酸-苯酚法测定纯化后的玫瑰茄多糖，发现随着洗脱时间的延长，从第2管到第18管检测到了糖的存在，并且第10管的糖含量达到峰值(如图1)，收集了第6管到第14管的组分进行冻干，从而获得玫瑰茄多糖纯化组分.

图1 玫瑰茄纯化多糖的洗脱曲线

2.2 玫瑰茄多糖对HeLa细胞增殖的影响

采用0.5～4 mg/mL浓度的玫瑰茄多糖作用HeLa细胞后，HeLa细胞的增殖活性降低，并且随着多糖浓度的升高，细胞抑制率也升高，呈现正比例关系. 当玫瑰茄多糖浓度为2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL时，HeLa细胞增殖活性被显著抑制(P<0.05，P<0.01)(见图2).

图2 玫瑰茄多糖对HeLa细胞增殖的影响

2.3 玫瑰茄多糖对HeLa细胞相关凋亡蛋白的影响

2.3.1 玫瑰茄多糖对Bax蛋白的影响

Western Blot分析方法是一种可以检测样品内蛋白含量的方法.对于HeLa细胞内的Bax蛋白，与对照组相比，添加玫瑰茄多糖后HeLa细胞内的Bax蛋白含量明显增高(P<0.01)，随着玫瑰茄多糖浓度增大，Bax蛋白含量呈现剂量依赖性(图3).

图3 玫瑰茄多糖对HeLa 细胞中Bax 蛋白的影响

2.3.2 玫瑰茄多糖对Bcl-2蛋白的影响

对于HeLa细胞内的Bcl-2蛋白，与空白对照组相比，添加玫瑰茄多糖后HeLa细胞内的Bcl-2蛋白含量降低，与低剂量组相比，高剂量组的玫瑰茄多糖更能抑制HeLa细胞内Bcl-2蛋白的表达，与空白对照组存在显著差异(P<0.05)(图4).

图4 玫瑰茄多糖对HeLa细胞中Bcl-2蛋白的影响

2.3.3 玫瑰茄多糖对Bax/Bcl-2比值的影响

Bax和Bcl-2是细胞线粒体凋亡信号通路中的重要蛋白，Bax/Bcl-2比值的细微变化决定了细胞是否发生凋亡，如图5所示.对Bax、Bcl-2二者含量进行比较分析.添加玫瑰茄多糖后，低剂量组与高剂量组Bax/Bcl-2比值高于空白组(P<0.01)，并且随着玫瑰茄多糖剂量的提高，Bax/Bcl-2的比值也逐渐升高，呈现量效关系.

2.3.4 玫瑰茄多糖对pro-Caspase-3蛋白的影响

对于HeLa细胞内的pro-Caspase-3蛋白，与空白对照组相比，玫瑰茄多糖作用于HeLa细胞后，HeLa细胞内的pro-Caspase-3蛋白含量明显降低(P<0.05，P<0.01)，随着玫瑰茄多糖剂量的增大，pro-Caspase-3蛋白含量逐渐下降(图6).

2.3.5 玫瑰茄多糖对Caspase-3蛋白的影响

对于Caspase-3蛋白，添加高剂量玫瑰茄多糖后HeLa细胞内的Caspase-3蛋白含量明显升高，与空白对照组差异显著(P<0.05)； 与低剂量组相比，高剂量组的玫瑰茄多糖作用HeLa细胞后更促进HeLa细胞内Caspase-3蛋白的表达(图7).

3 讨论

研究表明多糖能刺激HeLa细胞，启动细胞凋亡通路中的相关蛋白.细胞凋亡通路有3种途径：内质网通路、死亡受体通路、线粒体通路[12]，其中线粒体通路是细胞凋亡最重要的一种途径.当细胞受到外界应激条件或药物刺激后，线粒体释放凋亡介质促进细胞凋亡[13].Bcl-2家族存在于线粒体中，是调节线粒体凋亡途径的关键因子，它们中的部分蛋白质是抗凋亡的，如Bcl-2，其余是促凋亡的，如Bax[14]，同时细胞的命运也由Bax/Bcl-2的比例微小的变化决定[15].外界刺激通过级联反应传导线粒体后，使Bax蛋白被活化，Bax在细胞内的表达升高后会增加线粒体外膜的通透性，引起细胞内半胱天冬氨酸酶活化从而引发促凋亡因子释放[16]，促凋亡因子活化Caspase-9，切割pro-Caspase-3使其转变为有活性的Caspase-3，导致细胞凋亡的发生.

本研究发现，4 mg/mL的玫瑰茄多糖作用于HeLa细胞，细胞中Bcl-2蛋白含量显著降低(P<0.01)，Bax蛋白含量显著升高(P<0.01)，这说明玫瑰茄多糖能够刺激HeLa细胞内Bax蛋白含量升高，Bcl-2蛋白含量降低.Bcl-2是抗凋亡成员，Bax则是具有代表性的促凋亡成员[17].Bax蛋白量升高，Bcl-2蛋白量降低，说明细胞线粒体凋亡通路被启动，同时Bax/BcL-2的比值升高，这说明玫瑰茄多糖可促进HeLa细胞发生凋亡.

Caspase的活化是一种级联反应，是按照一定顺序进行水解的复杂过程[18].Caspase-9作为体内Caspase级联的关键上游激活因子[19]，Caspase-9的前体在外来蛋白的切割下转变为有活性的Caspase-9，然后激活pro-Caspase-3，使其变为Caspase-3.很多研究将Caspase-3定义为细胞凋亡的执行者，Caspase-3蛋白含量的上升，代表凋亡已经发生[20].本研究发现，添加玫瑰茄多糖后，HeLa细胞内的pro-Caspase-3蛋白含量下降，而Caspase-3蛋白含量明显升高(P<0.05)，这说明玫瑰茄多糖能通过级联反应刺激pro-Caspase-3蛋白水解，成为Caspase-3，引起HeLa细胞凋亡.

综上所述，玫瑰茄多糖处理HeLa细胞后，细胞内Bax蛋白量升高，Bal-2蛋白量降低，同时pro-Caspase-3蛋白量降低，Caspase-3蛋白量提高.这说明玫瑰茄多糖可通过线粒体介导途径诱导HeLa细胞凋亡的发生.