铜对作物毒害的研究进展

郑冰静 许世初 屠钰欢 邹 帆 梁丹丹 王 海 莫亿伟

(绍兴文理学院 生命科学学院,浙江 绍兴 312000)

1 铜胁迫对植物生长和生理代谢的影响

铜是植物体正常生命活动所需的营养元素,广泛参与多种新陈代谢途径,在促进植物体优质增产和提高植物抗逆性方面均有重要作用[1].有研究表明,在正常植物体内,Cu2+含量约为5～30 mg/kg[2],低浓度Cu2+既是多种酶如硝酸还原酶的组成成分,又可为蛋白质的合成提供相应的辅酶和辅基[3],同时还是叶绿体上光合电子传递链的重要组分,适量Cu2+能促进蔗糖等碳水化合物向茎秆流动,促进花粉管的伸长等[4].近年来,由于冶炼、五金、采矿和电子产品等产业快速发展,重金属污染也日益加剧,每年土壤中的Cu2+增幅约为2.5～9.0 mg/kg,远远超过植物所需[2,5].Cu2+可随着大气循环、水循环进入农田生态系统,直接影响多种作物的生长,如受铜胁迫后会导致水稻植株瘦小,叶黄,分蘖减少,抽穗期和成熟期推迟,使作物生长发育迟缓,产量降低.Cu2+还可以通过食物链进行转移,若在人体内发生富集将直接危害人类健康[6-7].近年来,纳米材料已广泛应用于多种行业,而这些纳米颗粒(NPs)也具有植物毒性[8],如纳米氧化铜(nCuO)在500 mg/L时就能显著抑制玉米的生长,并能导致细胞膜透性的增加[9], 当Cu2+的浓度超过1.0 mg/L时,细胞膜相对透性会随着Cu2+处理浓度的上升而增大,其中Cu2+达8.0 mg/L时质膜透性达37.71%,过量Cu2+及纳米铜(nCu)对植物的生长及人类的健康均有伤害作用[10].

1.1 铜对植物种子萌发和幼苗生长的影响

在植物种子萌发和幼苗生长等阶段,受到温度、光照和无机盐等多种因素的强烈控制,如Cu2+、Fe2+、Zn2+和Mn4+等在植物体转运吸收及保护机制中存在紧密联系[11],其中,重金属胁迫在植物幼苗期影响最大[12].但在低浓度的铜、镉胁迫条件下,先农10号、20号、40号水稻发芽势和发芽率与对照相比无显著的差异,这可能是由于在种子萌发阶段,重金属铜、镉被阻隔在种表皮之外,因此没有造成胁迫伤害,有些反而还能促进种子的萌发[12-13].而在Cu2+和Zn2+复合溶液胁迫下,840 mg/L浓度时,蓖麻种子萌发率显著降低,仅为对照的45.07%,且随着复合浓度增加,种子根逐渐由绿转为黑[14].前人对重金属铜、镉抑制幼苗初期研究发现,Cu2+胁迫对水稻根的生长抑制效果最为明显,可能是水稻根直接与Cu2+的环境接触所致；随Cu2+浓度增加,其对根长的生长抑制作用更为强烈,而且对株高抑制作用也随Cu2+胁迫浓度递增而增强[15],随着Cu2+含量的增加,水稻的产量也呈指数下降[16].如在水培浓度为15～25 mg/L时,小麦胚根数目减少,水培7～10 d时,由于根尖受害萎缩,胚根条数与长度皆表现下降趋势[17],究其原因,铜的毒性可能直接损害了根系的生长和功能,从而抑制水分和养分吸收,进而影响地上部的生长发育[7].但在水稻生长的不同生命阶段,nCuO对水稻产生的毒害也不太一样, 如用0.5 mM、1.0 mM和1.5 mM的nCuO处理水稻种子时,会抑制种子萌发及地上部和根系的生长,并对水稻幼苗造成氧化损伤,自分蘖期开始,植株长度和生物量下降,在抽穗期,用高浓度nCuO(1 000 mg/L)处理后,则能对水稻植株引起致死效应[9].如高浓度的CuO-NPs(>100 mg/kg Cu)可导致根系渗出量增加,Cu2+吸收能力增强,植物根系长度和生物量降低,破坏地上部的铜稳态而改变了根系的形态[18].所以推测NPs毒性的机理如下：1)形成活性氧(ROS),产生氧化应激；2)NPs渗透进入细胞,干扰细胞代谢；3)NPs所释放的金属离子会影响酶功能正常发挥；4)DNA损伤或基因突变；5)NPs在植物体表面具有吸附作用,局部富集离子.铜毒害还可通过诱导植物细胞活性氧的产生,引起质膜透性增大,细胞中内容物渗出,严重将导致细胞死亡[9].

1.2 铜胁迫对植物根尖细胞分裂的根系生长的影响

1.3 铜胁迫对植物幼苗叶片叶绿素含量的影响

Mg2+是叶绿素的组成成分之一,有利于维持细胞结构完整,抵御不良环境[26],叶绿素含量的多少在一定程度上反映了植物生长状况和光合效率强弱,当叶绿素含量少时,势必降低光合速率.在铜胁迫的条件下,叶绿体结构受到破坏是铜胁迫毒害植物幼苗的重要表征之一[27],如受铜胁迫后作物的萌发率和生长受到显著抑制,叶绿素含量降低,影响其光合速率,使生物量下降,并降低多种酶活性,造成不可逆的毒害作用[13].随着铜胁迫的浓度增加,黑麦草的叶绿素含量呈明显降低趋势,当CuSO4质量浓度达320 mg/L,叶绿素a含量为对照组的33.6%,叶绿素b含量为对照组的37.5%,说明铜胁迫能显著降低叶绿素含量[28].深入研究发现,高浓度铜胁迫下,紫穗槐叶绿素a和叶绿素b的含量下降,重要的光合蛋白PsbD、PsbO和PsaA的表达量均下调,从而抑制了光合作用[29].究其原因,可能是重金属铜积蓄会引起细胞氧化损伤、干扰光合作用,进而影响了植物转运及输送营养能源[30].前人采用盆栽实验研究磷、铜对小麦的互作时,发现小麦缺铁是由铜毒害引起,小麦叶片黄化严重,叶绿素含量急剧下降[31].在小麦幼苗种植过程中添加外源钙有助于受铜胁迫小麦的解毒,当铜浓度为0.025 mM时,4 mM和8 mM的钙加入有助于提高叶绿素含量,并随浓度增加,效果更明显[1].此外,铜胁迫降低了植株的光合势和总叶绿素含量,抑制了叶绿素荧光,并降低了PSI、PSII和LHCII的活性从而影响光合作用[29,32].用不同浓度CuSO4处理1个月龄的紫菜幼苗6 d,发现子叶离体的真叶的光合色素含量显著下降.而CuSO4的毒性水平对真叶和子叶的光化学没有显著的负面影响.结果表明,紫草子叶具有规避铜毒害的潜力,可有效地用于铜污染土地的植物修复[33].当Cu2+为50 mg/kg时,苦草叶片叶绿素量达到最大值,而后叶绿素含量随着Cu2+浓度的增加而减少,最终趋于稳定[34].因此铜胁迫对叶片的伤害主要是影响叶绿素的合成,一方面可能抑制叶绿素合成酶的活性,另一方面可能直接影响叶绿体光合色素的形成或者导致光合电子传递链受损,从而致使光合速率降低[7].但是Cu2+对不同植物叶片具体的胁迫机制还需要深入探讨.

1.4 铜对植物抗氧化酶活性和抗氧化物质含量的影响

有研究表明,Cu2+作为一种氧化还原激活因子,可刺激ROS的产生,并引发植物的氧化应激反应,从而破坏和干扰多种重要的细胞生理过程,如电子传递、酶形成、光合作用、质膜通透性及其他代谢机制,最终表现出抑制植物的生长发育,而植物必须通过抗氧化酶防御系统来清除过多的ROS,从而免受氧化损伤[35-37].如芽孢杆菌USTB-O是一种抗铜细菌,施用芽孢杆菌USTB-O后,可提高小麦幼苗中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性,降低ROS和H2O2水平,降低铜对小麦幼苗的毒性[38]. 李锋民等[39]研究发现, 当Cu2+浓度大于0.5 mM时,其根部的SOD和POD受到显著抑制,其中最先接触Cu2+的根部会受到氧化胁迫伤害,由于Cu2+从根部运输到达地上部需要一定时间,所以地上部分受到氧化伤害的时间要晚于根部.过氧化氢(H2O2)是一种相对稳定易透过膜、可调节基因表达的辅助因子,参与各种生理过程[40],Zhang等[36]证实铜胁迫下,水稻胚根的H2O2作用于CuZn-SOD表达的上游,这些基因的过量表达会降低H2O2在水稻细胞中的积累,并通过上调抗氧化酶活性来增加水稻的耐受性.其中的抗坏血酸过氧化物酶(APX)、非特异性过氧化物酶(GPX)和SOD通常被用来评估铜对酶防御系统的氧化损伤作用,与对照相比,在250 μM铜胁迫下小麦幼苗APX、 GPX和SOD活性分别降低13.6%、27.3%和17.6%,在500 μM铜胁迫下小麦幼苗APX、 GPX和SOD活性分别降低了38.6%、40.9%和30.9%,而外源的吲哚-3-乙酸(IAA)或精胺(Spd)则能缓解铜毒害对小麦幼苗的APX、GPX和SOD活性的影响,提高小麦幼苗对铜胁迫的抗性[41].除了抗氧化酶参与对铜胁迫的抗性以外,抗氧化物质如谷胱甘肽(GSH)也可清除多余的ROS,与对照组相比,在高浓度的nCu胁迫下,小麦植株中的GSH含量降低至50%,同时在高浓度的Cu2+处理下,小麦植株中的GSH含量低至37%,说明小麦遭受氧化胁迫[21],导致植株体内的抗氧化系统受到伤害.

2 降低铜胁迫的相关措施

虽然大多数植物已经进化出一套适应性机制来部分缓解过量铜胁迫产生的危害,如液泡中的固存、金属螯合物的形成和细胞壁固定[42].然而,大量的研究表明,受重金属铜毒害的作物,其抗氧化防御系统(尤其是抗坏血酸-谷胱甘肽循环)受到破坏,并抑制其根部的正常生长发育,故如何有效解除铜胁迫成为维持植物正常生长发育中亟待解决的难题之一[43].有研究表明,添加外源NO、GSH、抗坏血酸、稀土等均能改善植物体根系生长发育环境,缓解Cu2+对幼苗的毒害.如施用氮肥时,可明显缓解水稻在低于50 mg/L Cu2+的胁迫,但当Cu2+浓度高于50 mg/L时,氮肥的施加反而明显抑制植物生长,对Cu2+的毒害效应起负相关作用[5].还有研究表明,给水稻幼苗供应NO3-有助于升高植物体内ROS水平,对调节机体稳态具有重要意义[22],外源GSH能显著提高在CuCl2胁迫下的水稻种子发芽率、发芽指数和活力系数,同时增加根长以及根生长的数量,其中100 mg/L的GSH对提高水稻种子萌发的效果最明显；同时浓度为50 mg/L和100 mg/L的GSH对缓解铜对幼根的毒害效应最显著[44].施用外源GSH可减少水稻和棉花中过量的Cu2+积累,对维持矿质动态平衡有积极作用,结果表明施用外源的GSH可抑制植株对Cu2+的积累,维持Ca2+、Mg2+的稳态,保护光合色素,激活抗氧化防御机制[45].

外添稀土元素镧可提高水稻对铜胁迫的抗性,降低质膜的透性[3].而从小麦根中分离的内生细菌B.altitudinisWR10具有很高的抗铜性(2 mM)和生物吸附能力, 在铜胁迫下, 施用B.altitudinisWR10作菌肥的小麦比未接种WR10的小麦根长和干重分别高了1.39倍和1.56倍,同时WR10还减轻了铜引起的锌和锰缺乏症[38].此外,添加外源硅对受铜胁迫的小麦幼苗具有缓解作用,对根尖组织进行亚显微结构观察,发现不加硅的小麦根尖细胞在铜逆境胁迫下出现质壁分离现象,内质网、高尔基体、线粒体等细胞器空泡化或消失,而添加外源硅的小麦根尖细胞的内质网与线粒体细胞器仍在,未见内质网空泡化,说明添加外源硅后能降低铜胁迫对小麦根尖细胞器造成的损伤[46].另外,硫硅配施也可在铜污染的农田中降低铜在水稻中的生物积累量,加快生长速度,其中0.013 g/kg的硫肥与1.0 g/kg的硅肥合理配施效果佳[47].此外,50 μM IAA和1 000 μM Spd可缓解小麦种子受铜胁迫的效应,改善幼苗生长状况、提高相对含水量、渗透保护剂浓度、抗氧化系统活性并改善茎组织结构,同时减少电解质渗漏[41].还有研究表明,除草剂(DCMU)能降低Cu2+毒害引起的氧化损伤,提高谷胱甘肽还原酶、抗坏血酸和POD的活性,从而增强细胞的抗氧化能力[24],而外源的DCMU如何提高植株对铜胁迫的抗性还需要深入研究.

在分子水平上,有研究表明,超表达水稻OsHIP24、OsHIP34和OsHIP60基因后会明显提高水稻对铜、锌和镉的抗性.经体外金属结合试验表明,OsHIP24蛋白质能与铜和镉结合,对过量的铜和镉有缓解的作用[48].其中OsHIP24在根成熟区的根和茎维管束中表达较高,包括在叶片、节和节间等,表明了将Cu2+有输入维管束的可能作用,OsHIP24通过维管束途径对Cu2+从根到茎的远距离转运起着重要作用,还会直接影响到花药的发育[49].同时,还有研究发现,OsHIPP24在水稻中突变会增加根中的Cu2+浓度,但OsHIPP24强大的远距离运输能力引发了茎中更大的铜积累.因此,当这些相关的基因突变后,则表现出植株发育迟缓[48].受铜胁迫的植物会在一定程度上形成适应机制,如水稻中OsHMA4基因在叶片表达,可将籽粒铜阻隔在液泡外,减少铜在水稻中的富集作用,从而在一定程度上增强对铜的耐受性[50-51].因此不同植物在受到铜胁迫后会产生相应的策略来降低伤害,以提高生存能力.

3 研究铜胁迫必要性和未来的研究展望

虽然前人在植物应对铜胁迫方面已取得很多的成果,但不同植物间对铜胁迫的耐性和引起毒害的浓度也有差异,而且随着电子产品废弃物垃圾的增多,城市周边的土壤和农作物受Cu2+的毒害将会更加严重.Cu2+通过农作物根系吸收后,积累在粮食和蔬菜等多种作物的体内,通过食物链直接影响到人类的健康,所以将来的研究应该加强在生理和分子水平上Cu2+对不同作物伤害机制和可能耐铜机制的探讨,并厘清Cu2+在主要农作物吸收和代谢过程的示踪及其在食物链中的传递方向,最终在生理、细胞和分子水平上阐明铜胁迫对主要农作物的伤害机制,深入了解作物对铜隔离和拒铜机制,为将来在生产上进一步采取相应的农艺措施或基因工程育种手段来降低铜胁迫提供新的理论依据.