珍珠粉提取物对人A375黑色素瘤细胞黑素合成的影响

陈 怡 罗 文

(绍兴文理学院 生命科学学院，浙江 绍兴 312000)

人的皮肤依次由表皮、真皮和皮下组织构成，其中表皮又分为角质层、透明层、颗粒层和基底层四层组织.黑素细胞存在于表皮基底层，呈树状突起，其细胞内形成的黑色素通过树状突起运输到角质层，形成皮肤的颜色和色素沉积.色素的形成一方面可以吸收紫外线，防止皮肤细胞遭受紫外线的损害，另一方面色素会使皮肤变黑并且形成色斑影响美观.因此寻求既能保护皮肤细胞又具有美白作用的护肤品一直是人们不懈的追求.珍珠粉自古就是美容润肤之佳品，据李时珍的《本草纲目》记载：“珍珠涂面，令人润泽好颜色，涂手足，去皮肤逆胪，能化面去黯，令光泽洁白”.清末的慈禧太后，年过六十皮肤仍润泽柔滑，经考证与她长期内服外用珍珠粉有关[1].现代典籍《中华人民共和国药典》亦记载有珍珠具有润泽肌肤的功效[2].然而对于珍珠粉，人们只知道它具有美白润肤的效果，到底是珍珠粉中何种成分起到美白作用还了解甚少，因此本研究以人A375黑色素瘤细胞为模型，通过添加珍珠粉提取物，探究珍珠粉的美白作用.

1 材料和方法

1.1 实验材料

细胞：人A375黑色素瘤细胞：购自中国科学院上海细胞研究所；珍珠粉：购自诸暨市山下湖珍珠有限公司；试剂：MTT细胞增殖检测试剂盒，多巴胺，DMEM培养基，胎牛血清(FBS)等试剂均购自美国BBI公司.

1.2 实验方法

1.2.1 珍珠粉提取物的制备

配制pH 4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液， 将珍珠粉与缓冲液以1∶25(g∶mL)的比例混合，搅拌30 min后， 静置12 h， 将反应液离心5 min(5 000 r/min)，取上清液置于真空冷冻干燥机中冻干，即为珍珠粉总提取物；重复上述步骤，将上清液倒入透析袋中透析72 h，取透析液置于真空冷冻干燥机中冻干，即为珍珠粉蛋白提取物[3].

1.2.2 细胞增殖活性的测定

取A375细胞置于DMEM培养基中，添加10% FBS，调整细胞浓度为2×105个/mL，按每孔100 μL接种至96孔板，培养24 h.分别取珍珠粉总提取物和蛋白提取物配制成0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL样品，加入各孔板中，每组平行5次，对照组添加等量培养基，继续培养12 h，24 h，36 h，48 h.培养结束前4 h加5 mg/mL的MTT10 μL，继续培养4 h后，吸出培养液，每孔加入90 μL DMSO，将96孔板置于微孔板振荡器震荡10 min，490 nm波长下测定吸光度值[4].

1.2.3 酪氨酸酶活性的测定

取A375细胞，调整细胞浓度为2×105个/mL，按每孔100 μL接种至96孔板，培养24 h后弃培养基，添加0.2 mg/mL珍珠粉总提取物和珍珠粉蛋白提取物，每组平行5次，继续培养24 h.培养结束后，用pH 7.4的0.01M的PBS洗涤2次，弃上清液.每孔加1%Triton-X溶液90 μL，迅速置-80 ℃冰箱内放置30 min，反复冻融两次.37 ℃预热，每孔加入0.5%多巴胺溶液50 μL，37 ℃下反应1 h，490 nm波长处测定OD值[5-7].

1.2.4 黑素含量的测定

取A375细胞，调整细胞浓度为2×105个/mL，按每孔1 mL接种于24孔板，培养24 h后吸出培养液，加入0.2 mg/mL珍珠粉总提取物和珍珠粉蛋白提取物1 mL，每组平行5次.同时设空白对照组，对照组添加培养液1 mL，继续培养24 h.培养结束后，用0.25%的胰蛋白酶进行消化，将细胞收集入离心管中离心10 min(1 000 r/min)，倾去上清液，用PBS洗2次后，取下层沉淀，加1 mol/L氢氧化钠溶液，37 ℃作用48 h，加入100 μL左旋多巴，490 nm波长处测定OD值[5,7].

1.2.5 紫外线照射下A375细胞酪氨酸酶活性和黑色素含量的测定

将A375细胞分为四组，每组设五个平行.第一组即对照组：细胞无紫外线照射也添加珍珠粉提取物；第二组即实验组1：细胞进行紫外线照射但不添加珍珠粉提取物；第三组即实验组2：细胞添加珍珠粉提取物后再进行紫外线照射；第四组即实验组3：细胞进行紫外线照射后再添加珍珠粉提取物.分光光度法测定细胞酪氨酸酶活性和黑色素的含量，方法同上.紫外灯发射的紫外线波长为290 nm～390 nm，峰值为365 nm，灯管垂直下方30 cm处的紫外线指数为150 μW·cm-2，实验中紫外灯照射时间均为90 s.

1.3 统计学方法

所测数据采用SPSS 21.0统计软件进行统计，数值以平均值±SD表示，组间比较采用单因素方差分析检验(ANOVA)，P<0.05有统计学意义.

2 实验结果

2.1 珍珠粉提取物的制备

经乙酸-乙酸钠缓冲液提取获得珍珠粉总提取物和珍珠粉蛋白提取物如图1所示，总提取物呈白色颗粒状结晶，蛋白提取物呈淡黄色粉末状颗粒.

珍珠粉总提取物 珍珠粉蛋白提取物

2.2 珍珠粉提取物对A375细胞增殖活性的影响

对于空白对照组，A375细胞呈长梭形，如图2A、图2D所示，随着培养时间的延长，细胞密度逐渐增加.当添加珍珠粉总提取物和珍珠粉蛋白提取物时，细胞增殖活性随着浓度的升高而下降，如表1所示：当作用12 h、珍珠粉总提取物浓度为0.4 mg/mL、0.8 mg/mL时，细胞增殖活性降低，与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.05)；当作用24 h、珍珠粉总提取物浓度为0.4 mg/mL、0.8 mg/mL时，与空白对照组相比，细胞增殖活性仍降低(P<0.05)，当珍珠粉总提取物浓度为0.2 mg/mL、作用24 h时，细胞增殖活性OD值为(0.107±0.007)，与空白对照组相比差异不显著；当作用36 h、48 h时，随着浓度的增加，细胞增殖活性继续降低(P<0.01).

空白对照组 添加0.2 mg/mL 添加0.8 mg/mL 空白对照组 添加0.2 mg/mL 添加0.8 mg/mL

表1 珍珠粉提取物对 A375 细胞增殖的影响

对于蛋白提取物，当添加浓度为0.4 mg/mL、0.8 mg/mL时，抑制细胞的增殖，与对照组相比具有显著性差异(P<0.05).当添加浓度为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL时，蛋白提取物对细胞增殖活性无影响.综上所述，为了使珍珠粉提取物对A375细胞的增殖活性影响最小，故后续试验选取0.2 mg/mL的添加剂量和24 h作为最佳浓度和作用时间.

2.3 珍珠粉提取物对细胞酪氨酸酶和黑色素含量的影响

取0.2 mg/mL珍珠粉提取物作用于A375细胞24 h，细胞酪氨酸酶活性和黑色素含量如图3所示：总提取物和蛋白提取物会增加酪氨酸酶活性，与对照组相比均有显著性差异(P<0.05).总提取物和蛋白提取物会促使细胞产生黑色素.当添加总提取物时，细胞黑色素含量OD值为(0.063±0.009)与对照组(0.051±0.012)相比具有显著性差异(P<0.05)；当添加蛋白提取物时，细胞黑色素含量OD值为(0.086±0.008)与对照组(0.051±0.011)相比差异极显著(P<0.01).

珍珠粉提取物对细胞酪 珍珠粉提取物对细胞

2.4 紫外照射下珍珠粉各提取物对细胞酪氨酸酶活性和黑色素含量的影响

在紫外照射下，细胞酪氨酸酶活性和黑色素含量如表2所示.对于珍珠粉总提取物，经紫外线照射的实验组1、2、3与未有紫外线照射的对照组相比，细胞内酪氨酸酶活性增大(P<0.05)，黑色素含量增多(P<0.05)，这说明紫外线的照射，确实能够促进A375细胞内酪氨酸酶活性，促进黑色素的产生.然而实验组2、3与实验组1相比，细胞酪氨酸酶活性增大，具有显著性差异(P<0.05)，而黑色素含量变化不明显没有显著性差异，这说明珍珠粉总提取物能够刺激A375细胞酪氨酸酶的活性，但不会增加黑色素的产生.

对于珍珠粉蛋白提取物，经紫外线照射的实验组1、2、3与未有紫外线照射的对照组相比，细胞酪氨酸酶活性增大，具有显著性差异(P<0.05)，黑色素含量增多，差异显著(P<0.05).然而添加珍珠粉蛋白提取物的实验组2、3与未添加珍珠粉蛋白提取物的实验组1相比，酪氨酸酶活性没有显著性差异，而黑色素含量却减少，差异显著(P<0.05).这说明珍珠粉蛋白提取物在紫外线的照射下，并没有增加细胞内酪氨酸酶的活性，却能够抑制黑色素的生成，具有抵抗紫外线、美白的作用.

3 讨论

3.1 酪氨酸酶及黑色素的形成机理

黑素细胞起源于胚胎神经嵴，具有树状突起，属于腺细胞[8].黑色素的合成必须有3种基本物质：酪氨酸、酪氨酸酶和氧，可大体分为两个阶段，如图4所示：第一阶段是由酪氨酸酶催化酪氨酸形成L-多巴，L-多巴进一步氧化生成多巴醌.第二阶段以多巴醌为原料，一方面通过多巴醌转变为多巴色素形成真黑素，另一方面多巴醌可以转变成谷胱甘肽多巴和半胱氨酰多巴，从而生成褪黑素.真黑素和褪黑素在细胞内共同作用， 最终形成黑色素[9-11]. 形成的黑色素在皮肤内被分解、溶解和吸收后穿越基底膜，被真皮层的嗜黑色素细胞吞噬后，通过淋巴液带到淋巴结再经血液循环从肾脏排出体外；黑色素也通过黑素细胞树状突起，向角质形成细胞转移，然后随表皮细胞上行至角质层，形成色素沉积和色斑[12-14].酪氨酸酶是酪氨酸转变为多巴醌的催化剂，由酪氨酸酶相关蛋白-1和酪氨酸酶相关蛋白-2组成[15-16].霍仕霞等[17]发现，酪氨酸酶相关蛋白-1能氧化酪氨酸酶相关蛋白-2产生色素颗粒，加速真黑素的形成，进而形成黑色素的沉积.

图4 黑色素形成机理图

黑色素的合成也受细胞外多种生理刺激物的影响，如促黑素细胞激素，雌激素和紫外线等[18].黑色素可吸收或反射紫外线UVA，保护深部组织免受辐射损伤[19].UVB辐照是诱导皮肤色素沉着的强烈外源性刺激因子，它除了能够促使角质形成细胞合成分泌多种神经肽和促炎因子间接刺激黑素细胞合成分泌黑素外，还能够促进黑素小体从黑素细胞至角质形成细胞的转运过程[20-21].虽然黑色素能对皮肤起到光保护作用，但其在皮肤中蓄积产生的色素斑点会不同程度地影响美观[22]，因此人们一直在寻求美白护肤的产品.

3.2 珍珠粉提取物对酪氨酸酶及黑色素的作用

本研究结果表明：在无紫外线照射下，添加珍珠粉提取物，A375细胞的酪氨酸酶活性和黑色素含量增加，这说明珍珠粉提取物具有刺激A375细胞产生更多的酶和黑色素的潜能，以抵抗外界带来的不良反应如紫外线的伤害.当有紫外线照射后，A375细胞中的酪氨酸酶和黑色素含量增加，这一结果与常建民[23]的研究结果相一致，即紫外线可以刺激细胞产生黑色素，从而保护细胞免受辐射伤害，然而当给予珍珠粉提取物后，这一结果发生了改变.对于珍珠粉总提取物，无论是紫外线照射前添加还是照射后添加，A375细胞的酪氨酸酶活性都增加(P<0.05)，这说明珍珠粉总提取物中含有刺激酪氨酸酶活性的物质成分，但是A375细胞中的黑色素含量并未明显增加(P>0.05)，这说明珍珠粉总提取物中含有抑制黑色素合成的物质成分.酪氨酸酶活性的升高，确实能促使酪氨酸转变成多巴和多巴醌，但多巴醌会转变成多巴色素和谷胱甘肽多巴与半胱氨酰多巴，前者即多巴色素在酪氨酸酶的进一步催化下形成色素颗粒，而后者即谷胱甘肽多巴与半胱氨酰多巴确能生成褪黑素，只有当色素颗粒含量多于褪黑素时，才能最终形成黑色素，因而单纯的酪氨酸酶活性的升高不能直接说明黑色素的含量就一定增加.

同样，对于珍珠粉蛋白提取物，无论在紫外线照射前还是照射后添加，A375细胞内酪氨酸酶活性并未有显著变化(P>0.05)，而黑色素含量确在减少，这说明珍珠粉蛋白提取物中也存在抑制黑色素合成的物质成分.

珍珠粉蛋白提取物是在珍珠粉总提取物的基础上，经过透析后获得的.与珍珠粉总提取物相比，珍珠粉蛋白提取物缺少钙离子等矿物质.研究表明[24]，细胞外钙离子对皮肤屏障功能的形成至关重要，在皮肤屏障破坏时，若能将钙离子浓度恢复至正常生理范围，受损的皮肤和皮肤屏障功能可更为迅速地恢复.因而认为珍珠粉总提取物中的钙离子或其他矿物质使酪氨酸酶活性升高，但提取物中的某种成分会抑制黑色素的合成.透析后由于钙等离子流失，使得珍珠粉蛋白提取物作用紫外线照射后的A375细胞后，细胞中的酪氨酸酶活性未有改变，但抑制黑色素合成的成分还在，因而黑色素的含量下降，从而实现美白作用.对于珍珠粉中抑制黑色素合成的成分到底是什么以及珍珠粉提取物尤其是蛋白提取物如何刺激多巴醌，进而影响色素颗粒和褪黑素含量的改变有待研究，并且为什么珍珠粉提取物必须在紫外线作用下才能实现美白作用也仍需进一步探究.