核磁共振波谱法同步定量复合维生素B片中有效成分

鲁瑞娟 许秋梅

(绍兴文理学院 分析测试中心，浙江 绍兴 312000)

复合维生素B片是一种常见的非处方药.为复方制剂，每片含5种有效成分：3 mg维生素B1、1.5 mg维生素B2、0.2 mg维生素B6、10 mg烟酰胺以及1 mg右旋泛酸钙.辅料为：磷酸氢钙、玉米淀粉、羟甲淀粉钠、糊精和硬脂酸镁.按照卫生部标准WS1-73(B)-89[1]，烟酰胺采用滴定法测定含量，维生素B2采用紫外分光光度法测定含量，维生素B1采用重量法测定含量.上述方法操作烦琐，每种成分的测定方法都不相同，且未记载泛酸钙和维生素B6的含量测定方法.

目前，测定复合维生素B片中有效成分含量的方法研究主要有高效液相色谱(HPLC)法以及毛细管电泳法.采用HPLC法[2-4]时，较少提及泛酸钙的含量测定方法，且对待测样品纯度要求较高，仅徐硕等[5]报道了HPLC法同时测定一种5类维生素含量均为50 mg/片的进口复合维生素B片中这5种成分含量的方法.毛细管电泳法[6-8]测定时，同样的较少提及泛酸钙含量的测定方法，仅胡雯雯[9]等采用高精度定量毛细管电泳法同时测定复合维生素B片中这5种维生素含量.这两种方法准确度高、结果可靠，但样品预处理操作比较复杂，且均需提供待测物对照品.

定量核磁共振波谱(QNMR)法无须引进任何校正因子就可以直接根据各定量峰的积分值推算所代表的自旋核的数量[10].相较于目前主流的定量方法，其样品预处理操作简单、无需待测物对照品、不破坏样品且测定快速准确，现已越来越广泛的应用于药物分析领域[11-12].QNMR法于2010年收录于《中华人民共和国药典》[13].QNMR法测定复合维生素B片中有效成分含量的研究也已经有所报道，郭强胜等[14]建立了用QNMR法测定复合维生素B片中4种维生素含量的方法，操作简单，结果可靠，但维生素B6因含量低而未能检测.EIFF等[15]用QNMR法分析水溶性和脂溶性维生素，在同步定量维生素E、B1、B3、B5以及B6时得到较好的检测结果，但未对维生素B2进行同步定量分析.两者均未涉及复合维生素B片中所有有效成分的同步测定，本文在他人工作的基础上，采用QNMR法，设计合适的预处理过程，优化采样参数，有效控制分离所有有效成分，解决含量差异带来的检测困难，建立了一种简单、快速且无需对照品的同时测定复合维生素B片中5种维生素含量的方法.

1 实验部分

1.1 仪器

400 MHz核磁共振波谱仪(AVANCE Ⅲ，瑞士Bruker公司)；百万分之一天平(CPA2P，德国Sartorius公司)；高速离心机(LG10-2.4A，北京京立离心机有限公司)；超声波清洗器(SK3210HP，上海科导超声仪器有限公司).

1.2 试样和试剂

复合维生素B片购于本地药房；顺丁烯二酸(阿拉丁试剂有限公司，经重结晶处理，用邻苯二甲酸氢钾标定后含量为98.78%)；邻苯二甲酸氢钾(阿拉丁试剂有限公司，核磁定量标准，批号：P112254)；氘代二甲基亚砜、重水(百灵威试剂有限公司)；维生素B1标准品(中国食品药品检定研究院，批号：100390-201806)，维生素B2标准品(中国食品药品检定研究院，批号：100369-201504)，维生素B6标准品(中国食品药品检定研究院，批号：100116-201906)，泛酸钙标准品(中国食品药品检定研究院，批号：100370-201903)，烟酰胺标准品(中国食品药品检定研究院，批号：100115-201604).

1.3 供试品溶液配制

取复合维生素B片10粒，用研钵磨成粉末，精确称取适量该粉末，与精确称重的内标物顺丁烯二酸一起置于5 mL圆底样品管中，加入DMSO-d6(氘代二甲基亚砜)0.55 mL，保持20 ℃在超声波清洗器中溶解10 min，使其充分溶解，转速8 000 rpm离心1 min，将上清液移入Φ5 mm核磁管，加入适量D2O(重水)摇匀静置10 min后，进行核磁共振定量测定.

1.4 核磁共振谱仪的调节

将待测样放入核磁共振波谱仪中，调整仪器参数：脉冲序列：zg30，谱宽SW：20.55 ppm；采样时间AQ：3.98 s；采样温度T：298 K.仔细匀场后采样，获得1H-NMR谱.再进行细致认真的相位校正，对5种有效成分和内标物的定量峰逐一进行积分.每次测定积分至少重复5次，结果取平均值.

2 结果与讨论

2.1 定量峰的选择

复合维生素B片的1H-NMR谱图如图1所示，δ6.05为内标物顺丁烯二酸的谱峰.

图1 复合维生素B片的1H-NMR谱图

通过比较在相同条件下单一维生素片的1H-NMR谱图，排除多峰叠加的干扰信号，选择可用于定量分析的NMR谱峰位置见表1.

表1 复合维生素B片中5种有效成分与内标NMR定量峰的选择

样品中5种有效成分的定量峰除表1所示位置外，部分活泼氢受重水交换影响已经不可用于定量研究.维生素B1分离良好且非活泼氢的吸收峰在δ8.09处，其附近没有其他峰的干扰，故选为定量峰.维生素B2与泛酸钙情况相似，自身的两个等质子数峰相距较近，其中一个峰存在信号干扰，两者都选取没有干扰的峰进行定量.烟酰胺δ9.03，δ8.72处两峰的积分面积值相近，且都没有干扰信号，考虑到δ8.72峰离内标峰δ6.05更近，可避免射频场不同造成峰强差异的误差，故选择该峰作为定量峰.维生素B6含量比其他4种有效成分低一个数量级，本实验中，通过控制重水添加量，改变初始的干扰信号位置，得到分离度较好的δ4.52处定量峰；通过控制样品溶解量，使信噪比N/S>150，达到检测要求；通过增加扫面次数，使其重复测定峰面积的相对偏差(RDS)都小于3%，拥有较好的稳定性.从而实现了5种有效成分含量的同时测量.

2.2 样品前处理条件的确定

2.2.1 维生素B片溶解量的确定

取复合维生素B片10粒在研钵中磨成粉末.分别精确称取20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg复合维生素B粉末，置于5 mL圆底样品管中，加入DMSO-d6 0.55 mL，保持20 ℃在超声波清洗器中振动溶解10 min，使其充分溶解，转速8 000 rpm离心1 min，取上清液加入核磁管中，进行核磁共振定量测定.

以溶剂DMSO-d6中内含的0.03%的TMS为基准，标定积分面积，样品加入量与积分面积呈良好的线性关系.考虑到信噪比须大于150，且节省物料，因此取维生素B的加入量为50 mg.

2.2.2 重水交换中重水加入量的确定

首先要求学生查找相关资料，对该话题有一定的了解。众所周知，日本最初没有书面文字，是从中国的隋朝开始派遣隋使来到中国学习先进的知识和文化，把中国的文字引进日本。可以说日语的文字最初是完全借鉴中文，只是后来为了方便民众接受教育才又在汉字的基础上创造了平假名和片假名。汉字为日本后来的发展起到了卓越的贡献。让学生了解到这一点更加能够使学生对汉字的优美和历史地位感到自豪。

以上述加入50 mg复合维生素B粉末的样品为研究对象， 分别加入5 μL，10 μL，20 μL，30 μL，50 μL重水，得到的谱图如图2所示.随着重水交换量的不断增加，烟酰胺(δ8.72)以及泛酸钙(δ0.80)的定量峰基本不受影响，维生素B1(δ8.09)和维生素B6(δ4.52)的定量峰随着交换量的增加分离度变好，维生素B2(δ7.94)定量峰随着交换量的增加分离度变差.综合考虑各定量峰的分离度，取重水的加入量为20 μL.

图2 复合维生素B片加入不同重水量的1H-NMR谱图

2.3 核磁测试条件的选择

得到的1H-NMR谱图中的峰面积受多项实验参数影响，张友杰等[16]研究了峰面积与脉冲延迟时间、取数时间、采样次数、脉冲宽度和发射偏置等因素的关系，结果表明对于不同的检测试样，脉冲延迟时间和采样次数对峰面积的影响较大，其他参数的仪器默认值正好处于其建议范围之内，故分别研究了延迟时间和采样次数对复合维生素B片中各个特征峰峰面积所带来的影响.为了便于计算，本文将δ6.05处内标顺丁烯二酸的峰面积设置为10.

2.3.1 延迟时间对积分面积的影响

设置核磁共振扫描次数：NS=16(常规测试默认值)，其他参数同2.3(见表2).

表2 延迟时间对复合维生素B片各峰相对面积的影响

由表2可见，延迟时间较短时，峰面积变化明显，当延迟时间d1≥10 s时，各定量峰峰面积变化趋于稳定，为了节省实验时间，提高检测效率，本实验选取d1=10 s.

2.3.2 采样次数对积分面积的影响

设置核磁共振脉冲延迟时间：d1=10 s，其他参数同2.3(见表3).

表3 采样次数对复合维生素B片各峰相对面积的影响

由表3数据可以看出，采样次数少，数据的重现性会比较差，在ns ≥64次后，各定量峰面积的变化趋于稳定，因此，为了节省实验时间，提高检测效率，本实验选取NS=64次.

2.4 复合维生素B片中5种维生素含量的测定

取待测复合维生素B片与内标顺丁烯二酸适量，按1.3节的方法得到待检溶液并放在核磁管中，避光室温保存.在5天时间内，每天按照2.1节的方法进行QNMR检测，测得复合维生素B片中5种有效成分的相对定量峰积分面积，如表4所示.

表4 存放时间对复合维生素B片各峰相对面积的影响

结果显示，在4天时间内得到的数据较为稳定，第5天测得的数据波动较大.说明复合维生素B片与内标顺丁烯二酸的DMSO-d6(含少量D2O)溶液在4天内于遮光的核磁管中具有很好的稳定性.这也说明本方法在同时测定维生素B片中的5种有效成分时具有很好的重现性.

2.4.2 含量测定

由1H-NMR谱图中得到样品定量峰和内标定量峰积分面积，并使用下面的公式计算样品的含量(Vt)：

(1)

其中，E表示当量(分子量/定量峰对应的质子数)；A表示峰面积；W表示称样量；下角标S表示内标物；下角标X表示样品.其中内标顺丁烯二酸的当量ES为58.04，峰面积AS都设为10，结果见表5.

由表5可以看到5份样品中含量处于中间值的维生素B1、B2以及泛酸钙的相对标准偏差均小于2%，而含量最多的烟酰胺与含量最少的维生素B6稳定性略差，但其相对标准偏差均小于5%，依旧符合定量检测的要求，结果稳定、可靠.所测复合维生素B的平均片重为77.07 mg，根据平均百分含量得到平均每片含维生素B1为2.96 mg、维生素B2为1.42 mg、烟酰胺为9.39 mg、泛酸钙为0.96 mg以及维生素B6为0.21 mg，测定值在药典规定的标示范围(90.0%～110.0%)内.

2.5 回收实验

在样品编号为1-5号样品的核磁管中分别加入维生素B1、维生素B2、 烟酰胺、 泛酸钙以及维生素B6标准品，超声振荡，溶解完全后，在相同条件下测定核磁共振氢谱，计算样品回收率，结果如表6所示.

表5 复合维生素B片中5种维生素的含量测定

表6 复合维生素B片中5种维生素的回收率测试

结果显示，5种维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸钙以及维生素B6的平均回收率均接近100%，且重现性良好，表明该方法准确度高、结果可靠.

3 结论

通过改进前处理方法、优化仪器参数，建立了同时测定复合维生素B片中所有有效成分的QNMR检测方法，其结果与样品的标示量基本吻合，测试结果的稳定性也比较好.通过对维生素B样品中的5种有效成分分别进行加标回收率测试，表明该检测方法的测试结果具有较好的精确度.由于复合样品中烟酰胺与维生素B6含量分别处于最大值与最小值，使得检测结果稳定性略差，但是相对标准偏差仍小于5%，依旧可以满足测试要求.因此该分析方法适用于复合维生素B片中所有有效成分的同时测定.本法操作简单，结果可靠.