基于碳点的比率荧光探针用于检测6⁃硫鸟嘌呤

梁志钢，任丹丹，程 霞，岑 瑶，许贯虹，魏芳弟，胡 琴

南京医科大学药学院，江苏 南京 211166

6⁃硫鸟嘌呤（6⁃thioguanine，6⁃TG）是最早被证明有助于治疗肿瘤疾病的嘌呤类似物之一，其呈现经典抗代谢细胞毒性作用。6⁃TG 作为一种无活性前体药物，经肝脏黄嘌呤氧化酶首过代谢后，转化成具有细胞毒活性的代谢物硫鸟嘌呤核苷酸（thiogua⁃nine nucleotides，TGN），TGN 继而渗入DNA 发挥抗肿瘤作用［1-2］。目前，6⁃TG 已被广泛应用于急性白血病的治疗，然而与许多细胞毒性药物一样，6⁃TG是一种安全剂量范围狭窄、不良反应强烈的抗癌药物，服用剂量过少起不到治疗作用，而服用较高剂量则存在潜在不良反应，尤其会引起骨髓抑制和肝损伤［3-5］，因此对该药物片剂进行质量控制尤为重要。

目前，用于检测6⁃TG 的方法有多种，包括比色法［6］、高效液相色谱串联质谱法［7］、伏安法［8］、表面增强拉曼散射［9］以及荧光分光光度法［10-13］等。其中基于荧光纳米材料的荧光传感器因其固有的灵敏度、简单性和快速性而极具吸引力［11］。但到目前为止，通过使用荧光纳米材料对6⁃TG的检测报道比较少，且都局限于单发射荧光探针。

本研究合成了发射蓝色荧光的碳点（carbon dot，CD）［14］，并将其与邻苯二胺（o⁃phenylenedi⁃amine，OPD）一起用于构建定量检测6⁃TG的新型比率荧光探针。

1 材料和方法

1.1 材料

氢氧化钠、6⁃TG、硝酸钠、还原型谷胱甘肽、L⁃半胱氨酸、胞嘧啶（上海阿拉丁试剂有限公司）；硫酸铜五水合物（上海生工生物工程股份有限公司）；三（羟甲基）氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）aminometh⁃ane，Tris）、OPD、氯化钡二水合物、氯化镁六水合物、滑石粉、羟丙基甲基纤维素（上海麦克林生化科技有限公司）；葡萄糖、尿嘧啶、抗坏血酸、可溶性淀粉（国药集团化学试剂有限公司）；氯化钾、尿素、无水三氯化铁（西陇化工股份有限公司）；无水碳酸钠（上海虹光化工厂有限公司）；硫酸镁（无锡民丰试剂有限公司）；硝酸铝（上海新宝精细化工厂）；氯化锰（上海实验试剂有限公司）；柠檬酸单水合物、二亚乙基三胺（上海西格玛奥德里齐贸易有限公司）；超纯水（Synergy超纯水装置）。

HITACHI F⁃7100 荧光分光光度计（深圳日立高新技术公司）；KQ5200F 型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；ZQLY⁃180F 振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司）；XW⁃80A 微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；AUW220D 十万分之一天平（岛津公司，日本）；梅特勒⁃托利多FF20 pH计（上海梅特勒⁃托利多仪器有限公司）；超纯水装置（Syn⁃ergy超纯水装置）。

6⁃TG 溶液配制方法：称取10.0 mg 的6⁃TG 于10 mL 离心管，加入5 mL 0.766 mg∕mL的NaOH溶液，超声使之溶解。取50.0 μL上述溶液于4 mL离心管中，再加入1.445 mL的水使之终浓度为0.4 mmol∕L。

1.2 方法

1.2.1 CD的合成

通过简易水热法制备得到CD［14］。将600 μL的二亚乙基三胺和1.2 g 柠檬酸单水合物溶于20 mL超纯水中。将上述混合溶液转移至30 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，于200 ℃加热4 h。冷却至室温后，用旋转蒸发仪浓缩得到棕色溶液。将得到的糊状物用丙酮离心洗涤3 次。真空干燥过夜后，将黄色产物溶于超纯水中备用，得到的CD溶液的浓度为2.3 μg∕L。置于4 ℃冰箱中避光备用。

1.2.2 实验条件的优化

为了考察不同实验条件对实验结果的影响，本研究依次对反应体系的pH、Cu2+与OPD 反应时间、体系中Cu2+的终浓度、Cu2+与6⁃TG 反应时间、CD 加入后反应时间进行了优化。

1.2.3 选择性实验

配制浓度为50 mmol∕L 的常见离子及其他物质的标准溶液（Na+、K+、Mg2+、NO3⁃、Cl⁃、SO42⁃、CO32⁃、尿素、葡萄糖、胞嘧啶、尿嘧啶、抗坏血酸）和浓度为1 mmol∕L的生物体内常见干扰物质溶液（半胱氨酸、谷胱甘肽），分别吸取20 μL 上述干扰物质与50 μL 400 μmol∕L硫酸铜溶液混匀，平行配制3份，放置于37 ℃摇床中孵育10 min。接着加入10 μL OPD溶液（40 mmol∕L）于37 ℃摇床中反应60 min。取出后，分别加入10 μL CD溶液，室温下放置5 min，测定荧光强度，计算碳点在450 nm 处与DAP 在560 nm 处的荧光强度比值F450∕F560。此外，分别配制模拟药片辅料的溶液，按照上述步骤进行选择性考察，比较不同干扰物质是否会对体系的荧光产生影响。

1.2.4 6⁃TG传感平台的方法学验证

标准曲线的绘制：配制浓度为400 μmol∕L 的6⁃TG标准溶液，分别取上述标准溶液10、20、40、50、60、70、80、85 μL 与50 μL 400 μmol∕L 的硫酸铜溶液、20 μL 的Tris⁃HCl 缓冲液（0.2 mol∕L，pH 7.0），再加入不同体积超纯水，使得离心管中溶液总体积为180 μL，用涡旋仪混合均匀，平行配制3 份，反应10 min。接着加入10 μL OPD 溶液（40 mmol∕L）于37 ℃摇床中反应60 min。取出后，分别加入10 μL CD 溶液，室温下放置5 min，测定荧光强度，根据6⁃TG浓度对检测平台的荧光强度比值绘制标准曲线。

验证：通过测定制备的模拟药片，对本方法的回收率、精密度进行了检验。该6⁃TG模拟药片每片重1.000 0 g，其中6⁃TG 的规格为25.0 mg，并加入了4.6 mg 羟丙甲基纤维素（hydroxypropyl methyl cellu⁃lose，HPMC）作为粘合剂，34.2 mg 滑石粉作为粘合剂，936.2 mg淀粉作为填充剂和崩解剂。按10片的量将细粉混合均匀后，准确称取适量，加入NaOH溶液超声溶解，再用0.22 μmol∕L 滤膜过滤后稀释，作为供试液。分别将低、中、高3 个浓度的上述6⁃TG供试溶液加入到检测体系中，按6⁃TG标准液制备的标准曲线进行测定，共平行测定3批。

2 结果

2.1 CD的表征

所合成CD 的UV⁃vis 吸收和荧光光谱如图1A所示。可以看出，CD 在240 nm 和353 nm 处有明显吸收峰，在450 nm处有一个非激发依赖的蓝色荧光发射。CD 的红外光谱进一步说明了其结构。如图1B 所示，3 418 cm-1处的峰对应O⁃H 键的伸缩振动特征吸收带，3 252 cm-1处的峰对应N⁃H基团的伸缩振动，1 556 cm-1处的峰对应N⁃H 基团的弯曲振动，1 655 cm-1处的峰为C=O 的伸缩振动峰，说明CD 表面有羧基和氨基。

图1 CD的表征图Figure 1 Characterization of carbon dot

2.2 基于CD检测6⁃TG的比率荧光探针构建原理

小分子物质OPD 本身没有荧光，但是在游离Cu2+存在的情况下，OPD能够被Cu2+氧化生成具有黄色荧光的DAP（图2A）。利用此反应，结合所合成的CD，构建了一种比率型荧光探针，用于准确地定量检测抗肿瘤药物6⁃TG。从图2B 可以看出，CD 不影响该体系中的Cu2+氧化OPD 生成发黄色荧光的DAP，但其荧光被淬灭。当该体系中加入6⁃TG 时，由于其结构中的硫原子可以和游离Cu2+结合形成稳定的复合物，从而抑制Cu2+对OPD 的氧化，减少了DAP 的生成。并且随着6⁃TG 浓度的增加，生成的DAP越少，其黄色荧光越弱，则对CD的荧光淬灭越少，CD 荧光逐渐恢复。因此，可以通过蓝光和黄光的荧光强度比值（F450∕F560）作为信号输出，实现对6⁃TG的定量检测。

图2 基于碳点的比率荧光探针用于检测6⁃TG的原理示意图Figure 2 Schematic illustration of the CD⁃based ratiometric fluorescence probe for the detection of 6⁃TG

为了进一步探明CD 荧光淬灭的原因，测定了OPD 和DAP 的紫外可见吸收光谱图，以及CD 的荧光光谱。如图3A 所示，OPD 无吸收，DAP 有较强吸收，且吸收光谱与CD的发射光谱有明显的重叠，因此，DAP 和CD 之间可能存在荧光内滤效应或者荧光共振能量转移。而Xu等［15］研究表明，当体系中生成DAP 时，CD 的荧光寿命未发生改变，并且CD 和DAP 均带正电荷，因此DAP 与CD 之间因静电排斥而无法靠近，故CD的猝灭是由于内滤效应。

从图3B 的谱线a 和b 可以看出，Cu2+氧化OPD生成的DAP和CD二者最大发射波长处的荧光互不干扰。当体系中加入CD后，生成的DAP使CD的荧光强度明显变弱。此体系中加入6⁃TG时，由于6⁃TG与Cu2+结合，生成的DAP减少，CD荧光恢复，因此所合成的CD与OPD符合构建比率荧光探针的条件。

图3 比率荧光探针机理验证Figure 3 Mechanism verification of the ratiometric fluo⁃rescence probe

文献表明，某些CD 的荧光可以被Cu2+猝灭［10］，也有一些CD不受Cu2+影响［15］，可能是不同碳源合成的CD表面性质差异所致。为了确定该比率荧光探针中Cu2+是否会对所合成的CD产生影响，考察了不同浓度的Cu2+对CD的荧光强度的影响（图4A）。在Cu2+浓度为0～300 μmol∕L 范围内，CD 的荧光强度保持相对稳定，表明Cu2+不会影响该CD 的荧光强度，所合成的CD 适用于与Cu2+和OPD 构建的比率荧光探针体系。同时，考察了其他常见金属离子（100 μmol∕L）对CD 荧光强度的影响（图4B）。在Mn2+、Fe3+、Al3+、Ba2+、Na+、Mg2+、K+存在的情况下，CD荧光强度几乎没有发生变化。表明所合成的CD在各种金属离子的存在下能够保持稳定。

图4 CD对金属离子的响应Figure 4 The responses of CD to kinds of metal ions

2.3 实验条件优化

为了获得足够高的灵敏度、确保反应比较充分，同时尽可能地缩短反应时间，最终选择了pH7.0的Tris⁃HCl（0.2 mol∕L）溶液作为缓冲液，Cu2+与OPD 反应时间为60 min，体系中Cu2+终浓度固定为100 μmol∕L，由于Cu2+与6⁃TG 反应10 min、CD 加入5 min 之后，该体系荧光强度比值保持不变，因此Cu2+与6⁃TG 反应时间、CD 加入后反应时间分别为10 min和5 min（图5）。

图5 实验条件优化图（n=3）Figure 5 The optimization diagram of experimental conditions（n=3）

2.4 选择性实验

为了考察该比率荧光探针对于定量检测6⁃TG的选择性，研究了各种可能存在的干扰物质在没有底物时对该体系的干扰。图6显示了这些物质的比率荧光值（F450∕F560），其中谷胱甘肽、半胱氨酸和6⁃TG的浓度为100 μmol∕L，抗坏血酸的浓度为500 μmol∕L，Na+、K+、Mg2+、NO3⁃、Cl⁃、SO42⁃、CO32⁃、胞嘧啶、尿嘧啶的浓度均为50 mmol∕L，辅料淀粉、滑石粉和HPMC的浓度分别为304.800 μg∕mL、11.370 μg∕mL和1.505 μg∕mL。

图6 常见干扰物质的影响（n=3）Figure 6 The effects of common interfering substances（n=3）

可以看出，实验的各种物质对体系基本没有干扰。其中，抗坏血酸由于具有还原性，可以将Cu2+还原，因此对该体系有一定的干扰，但其影响较弱，可以忽略。尽管半胱氨酸、谷胱甘肽中也含有硫原子，但是其对该比率探针的荧光强度没有明显影响，这归因于Cu2+与6⁃TG 硫醇基团间强的亲和力，且6⁃TG的pKa（7.44）低于谷胱甘肽pKa（9.20）、半胱氨酸pKa（8.00）［10］。因此6⁃TG 比半胱氨酸、谷胱甘肽更倾向于与游离Cu2+结合，该比率荧光探针对6⁃TG有更高的选择性，可以为6⁃TG提供可信的定量检测结果。

2.5 6⁃TG传感平台的方法学验证结果

本实验根据荧光强度比值与6⁃TG浓度的关系，实现6⁃TG 浓度的定量检测（图7）。随着6⁃TG 浓度的逐渐增大，反应体系的荧光强度比值（F450∕F560）也增大。6⁃TG浓度在40.00～160.00 μmol∕L范围内，体系荧光强度比值与6⁃TG 浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程为y=0.066x-2.537，R2=0.992，检测限（3σ∕K）为61.10 nmol∕L，其中σ为空白样品的标准偏差（n=10），K为标准曲线的斜率。

图7 6⁃TG浓度与荧光强度的关系（n=3）Figure 7 The relationship between the concentration of 6⁃TG and fluorescence intensity（n=3）

通过测定制备的模拟药片，对本方法的回收率、精密度进行了检验。由表1实验数据可以看出，低、中、高3个浓度的日内日间精密度的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于2.0%，回收率均在（101.5±3.5）%，由此证明该方法具有较高的精密度和准确度，可以用于实际样品中6⁃TG的测定。

表1 日内和日间精密度Table 1 The intra⁃day and inter⁃day precision（n=3）

3 讨论

6⁃TG是一种与鸟嘌呤结构相似的物质，20世纪50 年代初被引入临床，并首次在患者身上进行研究［16］。作为一种抗癌药物，6⁃TG通常用于治疗急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）。6⁃TG由于安全剂量范围狭窄，服用剂量小起不到良好的治疗作用，服用剂量大则存在潜在不良反应，尤其会引起骨髓抑制和肝损伤［4-5］。因此，对6⁃TG片进行质量控制尤为重要。

目前，越来越多的分析方法已被开发用于6⁃TG的定量检测，包括电化学法、高效液相色谱法、拉曼光谱法、比色法以及荧光分光光度法等多种分析方法。其中，基于荧光纳米材料的荧光传感器，例如量子点和碳点，由于高的量子产率、良好的稳定性和优越的光学特性［17-18］，近年来被广泛开发用于检测6⁃TG。Yu 等［10］通过简易的方法合成了一种硫、氮共掺杂的碳量子点（S，N⁃codoped carbon quantum dots，SNCQDs），并利用其设计了检测6⁃TG 的“turn⁃on”型荧光探针。Zeng 等［12］基于聚乙烯亚胺（poly⁃ethyleneimine，PFI）功能化的碳点构建了一种选择性的“turn⁃off”型荧光探针，可用于快速测定6⁃TG。

然而，目前用于定量检测6⁃TG 的荧光探针，无论是“turn⁃on”还是“turn⁃off”型荧光探针均属于单发射荧光探针，这类基于单波长荧光强度变化的探针容易受探针浓度、测试环境以及光程长度等因素的影响，因此在生物体系中适用于痕量物质的灵敏与定性分析，而不适用于准确的定量分析。而双发射荧光探针即比率型荧光探针是以两种波长的荧光强度比值作为信号输出，可以提供内置校准，有效地消除激光强度、背景信号等的干扰，所以能够提高分析方法的准确度，适用于精确的定量分析［19-20］。

本研究同时利用Cu2+的氧化性以及其与杂原子的配位能力，首次构建了一种用于定量检测抗肿瘤药物6⁃TG 的比率荧光探针。与单发射荧光探针以及其他分析方法相比，该方法简单易行，选择性好，准确度高，虽然灵敏度不太高，不能用于血药浓度的监测，但具有应用于实际6⁃TG 片剂含量检测的潜力。