蓝莓花色苷上调miR-141抑制脂多糖诱导的肺上皮细胞炎性损伤机制研究

李静 杨琴 张雪峰 杨吉明 唐丹丹

肺泡上皮细胞是肺脏结构和功能的基础，其炎性反应和凋亡在急性肺损伤的发生发展中起重要作用，抑制肺泡上皮细胞炎性反应和凋亡对急性肺损伤的治疗尤为重要。蓝莓又被称为蓝浆果、越桔等，除富含多糖、氨基酸、维生素和膳食纤维等多种营养物质丰富，还富含花色苷。蓝莓花色苷是一种天然的多酚类物质，具有抗氧化[1]、抑菌[2]、抗肿瘤[3]等生物活性。研究显示，蓝莓花色苷可通过降低对H2O2引起的血管内皮细胞氧化应激反应，减轻H2O2所致血管内皮细胞氧化损伤[4]；蓝莓花色苷可降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6的表达，降低大鼠神经功能缺损评分，对大鼠脑缺血再灌注损伤发挥较好的保护作用[5]。然而，蓝莓花色苷能否影响肺上皮细胞损伤还未知。miR-141是一种微小RNA(miRNA)，参与调控细胞凋亡、炎性反应和氧化应激等生理或病理过程，在肿瘤[6]、肠炎[7]、糖尿病肾病[8]等多种疾病中发挥重要调控作用。有报道称，miR-141在肺炎组织及脂多糖(LPS)诱导的人胚肺成纤维细胞MRC-5中表达降低，过表达miR-141可有效提高LPS诱导的MRC-5细胞活力，并抑制细胞凋亡及IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子的表达，miR-141可作为肺炎治疗的分子靶标[9]。因此，本研究建立LPS诱导的人肺上皮细胞BEAS-2B损伤模型，观察了蓝莓花色苷对LPS诱导的BEAS-2B细胞炎性因子表达和细胞凋亡的影响及其能否通过调控miR-141发挥作用，以期为其用于急性肺损伤的治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 BEAS-2B细胞系，武汉普诺赛生命科技有限公司；蓝莓花色苷，陕西承乾生物科技有限公司；LPS，美国Sigma公司；DMEM培养液、Annexin V-FITC/PI试剂盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒，北京索莱宝；胎牛血清(FBS)，杭州四季青；LipofectamineTM 2000试剂盒，美国Invitrogen公司；白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)试剂盒，南京建成；miR-141模拟物(mimics)、模拟对照序列(miR-NC)、miR-141抑制剂(anti-miR-141)、抑制剂阴性对照序列(anti-miR-NC)和PCR引物，上海生工；兔抗人活化的半胱天冬酶9(cleaved-caspase9)、活化的半胱天冬酶3(cleaved-caspase3)抗体，中国Abcam公司；miRNA抽提、逆转录和PCR试剂盒，大连宝生物。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染:在超净工作台内复苏BEAS-2B细胞，用含10% FBS的DMEM培养液于普通培养箱中培养。将对数期BEAS-2B细胞接种至6孔板中(5.0×105个/孔)，培养12 h后，用LipofectamineTM 2000脂质体法，分别转染miR-141 mimics、miR-NC、anti-miR-141、anti-miR-NC。转染12 h后，换新培养液。再培养24 h，RT-qPCR法检测细胞中miR-141表达验证转染效果，并收集细胞备用。

1.2.2 细胞分组处理:未转染的BEAS-2B细胞接种至6孔板中(5.0×105个/孔)，培养4 h后，弃培养液，分为对照组(Con组)、LPS组、LPS+蓝莓花色苷低剂量组、LPS+蓝莓花色苷中剂量组和LPS+蓝莓花色苷高剂量组，其中Con组细胞加常规培养液培养24 h，LPS组细胞加含10 μg/ml[10]LPS的培养液培养24 h，LPS+蓝莓花色苷低剂量组、LPS+蓝莓花色苷中剂量组和LPS+蓝莓花色苷高剂量组细胞分别加含10、20、40 μg/ml[4]蓝莓花色苷与10 μg/ml LPS的培养液共同培养24 h。转染miR-141 mimics、miR-NC、anti-miR-141、anti-miR-NC的BEAS-2B细胞均接种至6孔板中(5.0×105个/孔)，培养4 h后，弃培养液。其中转染miR-141 mimics、miR-NC的细胞处理同LPS组，并记为LPS+miR-141组、LPS+miR-NC组。转染anti-miR-141、anti-miR-NC的细胞处理同LPS+蓝莓花色苷高剂量组，记为LPS+蓝莓花色苷+anti-miR-141组、LPS+蓝莓花色苷+anti-miR-NC组。培养结束后，收集细胞培养上清液和细胞，进行相关指标检测。

1.2.3 酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液IL-6和IL-1β水平:将收集的各组细胞培养上清液离心(3 500 r/min、5 min)，取上清，分别参照IL-6和IL-1β试剂盒说明书，检测上清中其表达量。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡:将收集的各组细胞用磷酸盐缓冲液清洗2次，加500 μl结合缓冲液，重悬细胞。然后利用Annexin V-FITC/PI试剂盒，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 蛋白质印迹法检测细胞中cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白表达:将收集的各组细胞用磷酸盐缓冲液清洗2次，RIPA试剂提取细胞中总蛋白。经BCA法定量、电泳、转膜和封闭后，分别于cleaved-caspase9(1∶1 000)、cleaved-caspase3(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 500)一抗孵育液中4℃过夜。洗膜后，再于山羊抗兔二抗(1∶3 000)孵育液中，室温孵育1 h。加化学发光试剂避光显影，凝胶成像系统曝光拍照，Image J软件分析cleaved-caspase9、cleaved-caspase3相对于GAPDH的表达量。

1.2.6 RT-qPCR检测细胞中miR-141表达:将收集的各组细胞用磷酸盐缓冲液清洗2次，miRNA抽提试剂盒提取细胞中总RNA，经逆转录后，行PCR扩增。扩增程序：95℃5 min，95℃10 s，60℃45 s，72℃30 s，共35个循环。引物序列：miR-141上游5’-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3’，下游5’-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3’；内参U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。2-△△Ct法计算miR-141相对于U6的表达量。

2 结果

2.1 蓝莓花色苷对脂多糖诱导肺上皮细胞炎性因子表达的影响 与对照组比较，肺上皮细胞经10 μg/ml的LPS诱导后，IL-6和IL-1β表达升高(P<0.05)；蓝莓花色苷降低了LPS诱导的肺上皮细胞表达IL-6和IL-1β(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见表1。

表1 蓝莓花色苷对脂多糖诱导的肺上皮细胞炎性因子表达的影响

2.2 蓝莓花色苷对脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡的影响 与对照组比较，肺上皮细胞经10 μg/ml的LPS诱导后，凋亡率及凋亡相关蛋白cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的表达升高(P<0.05)；蓝莓花色苷降低了LPS诱导的肺上皮细胞凋亡率及细胞中cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的蛋白表达(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见图1，表2。

图1 蓝莓花色苷对脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡的影响；A 凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达；B 细胞凋亡流式图

表2 蓝莓花色苷对脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡的影响

2.3 蓝莓花色苷对脂多糖诱导的肺上皮细胞miR-141表达的影响 与对照组比较，肺上皮细胞经10 μg/ml的LPS诱导后，细胞中miR-141表达降低(P<0.05)；蓝莓花色苷促进了LPS诱导的肺上皮细胞中miR-141的表达(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见表3。

表3 蓝莓花色苷对脂多糖诱导的肺上皮细胞miR-141表达的影响

2.4 上调miR-141表达对脂多糖诱导的肺上皮细胞炎症损伤的影响 转染miR-141 mimics的肺上皮细胞中miR-141表达明显高于转染miR-NC的细胞(2.75±0.26比1.00±0.00，t=20.192，P<0.05)，表明上调miR-141的肺上皮细胞构建成功；上调miR-141降低了LPS诱导的肺上皮细胞表达IL-6和IL-1β(P<0.05)，且降低了细胞凋亡率及细胞中cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的蛋白表达(P<0.05)。见图2，表4。

表4 上调miR-141表达对脂多糖诱导的肺上皮细胞炎症损伤的影响

图2 上调miR-141表达对脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡的影响；A 凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达；B 细胞凋亡流式图

2.5 干扰miR-141表达降低蓝莓花色苷(40 μg/ml)对脂多糖诱导的肺上皮细胞炎症损伤的作用 转染anti-miR-141 的肺上皮细胞中miR-141表达明显低于转染miR-NC的细胞(0.32±0.03比1.00±0.00，t=68.000，P<0.05)，表明干扰miR-141吧表达的肺上皮细胞构建成功；与LPS+蓝莓花色苷+anti-miR-NC组比较，LPS+蓝莓花色苷+anti-miR-141组肺上皮细胞中IL-6和IL-1β的表达升高(P<0.05)，细胞凋亡率及细胞中cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的蛋白表达升高(P<0.05)。见图3，表5。

图3 干扰miR-141逆转蓝莓花色苷对脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡的作用；A 凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达；B 细胞凋亡流式图

表5 干扰miR-141逆转蓝莓花色苷对脂多糖诱导的肺上皮细胞炎症损伤的作用

3 讨论

急性肺损伤是常见的炎症性肺疾病，其病理改变主要表现为肺实质炎性反应而导致的弥漫性肺泡上皮和肺微血管内皮严重损伤，减轻肺泡上皮细胞炎性反应和凋亡可有效缓解急性肺损伤的发展进程[11]。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，是导致急性肺损伤在内的严重炎性疾病的诱导因素之一，常被用作体外建立肺泡上皮细胞损伤的诱导剂[12]。本研究结果显示，肺泡上皮细胞BEAS-2B经10 μg/ml的LPS诱导24 h后，细胞培养上清液中炎性因子IL-6和IL-1β的表达明显升高，且细胞凋亡率升高，与相关报道结果[13]一致，表明LPS诱导BEAS-2B细胞产生了炎性反应和凋亡，BEAS-2B细胞损伤模型建立成功。

蓝莓花色苷作为蓝莓的主要营养成分，还具有多种药理活性。研究显示，蓝莓花色苷可改善阿霉素诱导心衰大鼠心功能[14]；蓝莓花色苷可通过清除自由基，抑制细胞脂质过氧化反应，有效降低视网膜的细胞光损伤[15]。本研究结果显示，不同剂量(10、20、40 μg/ml)的蓝莓花色苷降低了LPS诱导的肺上皮细胞培养上清液中IL-6和IL-1β水平，提示其可抑制LPS诱导的肺上皮细胞炎性反应。过度的炎性反应可进一步刺激细胞凋亡。细胞凋亡受多种基因分子和信号通路的调控，其中caspase级联反应在细胞凋亡过程中发挥重要调控作用。caspase9处于caspase级联反应的首端，其被活化后向下游传递凋亡信号；caspase3处于caspase级联反应的核心地位，其在受到上游凋亡信号的刺激后被活化，进而执行细胞凋亡[16]。本研究结果显示，蓝莓花色苷可降低LPS诱导的肺上皮细胞凋亡率及细胞中cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达，且呈剂量依赖性，提示其可能通过抑制caspase级联反应来减少LPS诱导的肺上皮细胞凋亡。

miRNA是一类小分子非编码RNA，参与调控细胞增殖、凋亡等生命活动，可作为多种疾病的治疗靶点。研究显示，miR-141在LPS诱导的WI-38细胞炎症损伤模型中表达下调，上调其表达可促进LPS诱导的WI-38细胞活力并降低细胞中促炎因子的表达，减轻细胞炎症损伤，miR-141有可能成为婴幼儿肺炎治疗的分子靶点[17]；miR-141在缺氧/复氧(H/R)诱导的PC12细胞中表达降低，过表达miR-141可提高H/R诱导的PC12细胞活力，降低细胞凋亡率及氧化应激反应，从而减轻H/R诱导的PC12细胞损伤[18]；miR-141可通过抑制HDAC6介导的IkBα-NF-κB信号通路减少百草枯诱导的大鼠肺组织细胞凋亡、氧化应激和炎性反应，miR-141可作为保护大鼠肺组织免受百草枯损伤的分子靶点[19]。因此，本研究推测miR-141也可能参与肺泡上皮细胞损伤。

本研究结果显示，肺上皮细胞经LPS诱导后，细胞中miR-141表达降低，而过表达miR-141可降低LPS诱导的肺上皮细胞培养上清液中IL-6和IL-1β水平，并降低细胞中凋亡率及凋亡相关蛋白cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的表达，提示过表达miR-141可抑制LPS诱导的肺上皮细胞炎性反应及细胞凋亡，保护肺上皮细胞免受LPS损伤，miR-141有可能成为急性肺损伤治疗的分子靶点。本文结果还显示，蓝莓花色苷可呈剂量依赖性促进LPS诱导的肺上皮细胞中miR-141的表达，而干扰其表达则降低蓝莓花色苷对LPS诱导的肺上皮细胞炎性反应及凋亡的抑制作用，进一步提示蓝莓花色苷可能通过上调miR-141表达来抑制LPS诱导的肺上皮细胞炎性反应及凋亡。

综上所述，一定剂量的蓝莓花色苷可有效抑制LPS诱导的肺上皮细胞炎性因子表达和细胞凋亡，其可能通过上调细胞中miR-141的表达发挥作用，具有治疗急性肺损伤的潜在价值。