羌活提取物微乳剂制备及体外抗真菌活性

张智蕊, 赵 晴, 李宗霖, 寇俊杰, 李 娇, 徐凤波, 李庆山

(南开大学 化学学院，元素有机化学国家重点实验室，天津 300071)

当前，对于植物病害的防治主要以施用化学农药为主。世界卫生组织推测，每年有近 100 万吨农药被施用于地球地表[1]。农药的过度施用导致二氧化碳浓度升高、营养物质污染和耐药性出现[2-3]。因此，化学成分多样、低残留及广谱高效的新型可持续的植物源杀菌剂[4]受到广泛关注。如在美国颁布的《食品质量保护法》中要求减少化学农药的使用量，大力开发植物源产品作为化学农药的替代品[5]。目前，中国植物源农药登记产品较少，寻找合适的植物来源对开发植物源杀菌剂具有重要意义。

已有研究表明，一些植物源提取物显示出较好的抑制病原菌的作用[6-8]。Fielding 等[9]使用非洲加仑、欧洲风铃草、非洲风信子等8 种植物提取物与醚菌酯联合防治苹果灰霉病，均显示出优异的协同和相加作用。刘景坤等[10]发现，伞形科植物羌活Notopterygium incisumTing ex H. T. Chang地上部分提取物对尖孢镰刀菌、番茄早疫病菌和灰葡萄孢的生长具有显著的抑制作用，其中香豆素类化合物是其主要抑菌成分。植物羌活的干燥根茎和根是常用于治疗外感风寒、上肢风湿疼痛等的中草药(Notopterygii Rhizoma et Radix)，其主要成分为香豆素类和有机酸类化合物，具有显著的抗菌、消炎功效。为探讨中草药羌活在农业领域应用的可行性，本研究对其提取物进行了研究。

羌活提取物为深棕色混合物，水溶性较差，难以直接施用，而微乳剂的开发为其在农业抑菌中的应用提供了基础。微乳剂是一种透明或半透明且热力学稳定的液-液分散体系，与乳油相比，其有机溶剂的用量少，粒径小，具有安全、低毒、易被植物根部吸收等优点，且具有更为优良的外观和稳定性[11-13]。

鉴于此，笔者围绕羌活提取物微乳剂的制备工艺、性能及抑菌活性等方面开展研究，同时以制备的羌活提取物乳油为对照。通过测试微乳剂的稳定性、pH 值和降解率等性能指标，对羌活提取物、溶剂和乳化剂的含量等进行筛选，确定制备不同含量的羌活提取物微乳剂的最优配方，采用菌丝生长速率法对比分析其对植物病原菌的抑制活性；通过测定其接触角、静态表面张力和动态表面张力等指标表征其应用性能，旨在为羌活等中草药提取物在农业领域的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料与仪器

试剂与药剂：羌活醇 (notopterol)标准品 (纯度99.9%，成都普思生物科技股份有限公司)；乳化剂HMK-2100 (北京汉莫克化学技术有限公司)；消泡剂AF1506 (广州方中化工有限公司)；溶剂均为市售分析纯，未经处理直接使用。97%噻呋酰胺(thiofuramide) 原药 (湖北速普尔化工有限公司)；97%多菌灵(carbendazim)原药 (天津希恩思奥普德科技有限公司)。

中草药：干燥羌活 (Notopterygii Rhizoma et Radix) 饮片 (产地四川，北京同仁堂集团有限公司)。

供试菌株：禾谷丝核菌 (小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis)、辣椒疫霉Phytophthora capsici、水稻稻瘟病菌Pyricularia grisea和立枯丝核菌 (水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani)，由南开大学农药国家工程 (天津) 研究中心分离鉴定并保存。

仪器：SENCO-R206D 旋转蒸发仪 (上海申生科技有限公司)；JK99M 全自动张力仪 (上海中晨数字技术设备有限公司)；BP-100 型动态表面张力仪 (KRüSS)；UPR-11-5T 型超纯水器 (四川优普超纯科技有限公司)；Agilent Technologies 1200 Series高效液相色谱仪；ME20A 电子天平 (梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；接触角测量仪 (KRüSS)；动态干燥度分析仪 (法国Formulaction 仪器公司)；电磁式加热搅拌器 (Thermo Fisher Scientific (China)Co. Ltd) 。

1.2 试验方法

1.2.1 羌活中香豆素类活性成分的提取 将干燥羌活饮片粉碎成粒径约75 μm 的细粉。称取40 g粉末分散到400 g 70%的乙醇水溶液 (料液质量比1 : 10) 中，搅拌加热，回流2 h，冷却，抽滤，得到第1 次提取物溶液；向滤渣中加入400 g 70%的乙醇水溶液，回流提取2 h，冷却，抽滤，得到第2 次提取物溶液。合并提取液，减压脱除溶剂，得羌活提取物。

将羌活提取物用50 mL 纯水分散，不断振荡使其溶解后置于分液漏斗中，分次加入50 mL 乙酸乙酯，振荡后静置0.5 h，分出乙酸乙酯萃取液；向水层中加入50 mL 乙酸乙酯，重复上次操作，得到第2 次乙酸乙酯萃取液。合并两次萃取液，减压脱除溶剂，得膏状羌活提取物，收率7.17%。

采用高效液相色谱法 (HPLC) 测定其有效成分含量，采用C18色谱柱 (150 mm) ，流动相为乙腈(A) -水 (B) 梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长315 nm，进样量20 μL，柱温30 ℃，色谱条件列于表1。

表1 有效成分羌活醇高效液相色谱分析流动相组成Table 1 Mobile phase ratios in HPLC analysis of active ingredient notopterol

羌活醇对照品溶液配制：准确称取羌活醇标准品5.3 mg，配制质量浓度分别为0.53、0.26、0.13、0.07 和0.03 mg/mL 的羌活醇甲醇溶液，按照表1 条件进行HPLC 分析。

羌活提取物样品溶液配制：称取羌活提取物191.2 mg 于10 mL 容量瓶中，用色谱纯甲醇定容，振荡摇匀，使用微孔有机滤膜(Φ13 mm，0.45 μm)过滤，按照表1 条件进行HPLC 分析。

利用外标法绘制羌活醇工作曲线，并根据工作曲线计算羌活提取物中羌活醇含量。

1.2.2 羌活提取物微乳剂的制备及配方筛选

1.2.2.1 微乳剂的制备 采用转相乳化法[14]，分别将1.0 g 和3.0 g 羌活提取物加入装有搅拌装置的烧瓶中，匀速搅拌下依次加入溶剂、乳化剂、防冻剂和消泡剂，充分混合后成为透亮均匀油相。搅拌下缓慢滴加纯水，体系由透亮的油相逐渐变浑浊。继续加水搅拌，体系逐渐再次变成透亮溶液。加水补足设定质量后，在1500 r/min 下继续搅拌加热30 min，冷却至室温制得稳定的水包油(O/W)型的5%羌活提取物微乳剂及15%羌活提取物微乳剂。

1.2.2.2 溶剂的筛选 分别以二甲苯、环己酮、异丙醇、乙酸乙酯、甲醇和乙醇为供试溶剂，通过比较羌活提取物的溶解度和冷、热贮后的外观变化进行筛选。称取羌活提取物1 g，用滴管分次加入溶剂，每次0.2 g，记录羌活提取物完全溶解时溶剂的用量。

1.2.2.3 原药用量筛选 设置羌活提取物的质量分数分别30%、25%、20%、15%、10%和5%，通过观察其贮存稳定性及有效成分降解率的平均值筛选其最佳用量。

1.2.2.4 溶剂用量筛选 设置溶剂的质量分数分别为7%、9%、11%、13%、15%和17%，通过评估其稳定性及有效成分降解率进行筛选。

1.2.2.5 乳化剂用量筛选 设置乳化剂HMK-2100的质量分数分别为12%、14%、16%、18%、20%和22%，通过评估其稳定性及有效成分降解率进行筛选。

1.2.3 羌活提取物乳油的制备 将3.0 g 羌活提取物溶解于1.0 g 环己酮中，分别加入1.0 g HMK-2100 乳化剂、0.1 g 嵌段聚醚和4.9 g 乙醇，搅拌混合均匀后得到30%羌活提取物乳油。

1.2.4 微乳剂理化性能试验 在54 ℃下热贮14 d后，测定其降解率、乳液稳定性等性能指标[15]。

在0 ℃下保存1 h，观察有无固体或油状物析出，继续在0 ℃下贮存7 d 后，测定其降解率等性能指标[16]。

采用pH 计测定稀释100 倍后羌活提取物微乳剂的pH 值[17]。

使用标准硬水将试样稀释100 倍，在30 ℃ ±2 ℃的恒温水浴中静置1 h 后观察乳液分离情况[18]。

有效成分降解率按照表1 条件采用HPLC 测定。

1.2.5 抑菌活性测试 采用菌丝生长速率法[19]测定。将羌活提取物微乳剂用纯水分别稀释100、300 和500 倍，待测。取灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 49 mL 与1 mL 稀释后的待测微乳剂溶液混合，均分3 份于9 cm 培养皿中。冷却后，将1 cm供试病原菌菌饼接种于培养皿中央。以49 mL PDA与1 mL 纯水的混合物作为空白对照。在28 ℃恒温箱中黑暗培养7 d 后，用十字交叉法测量菌落直径，按公式 (1) 计算菌丝生长抑制率。

式中：I为抑制率，%；Dc为对照菌落直径，cm；Dt为处理菌落直径，cm。

1.2.6 微乳剂的应用性能测定

1.2.6.1 接触角的测定 采集新鲜且洁净的绿萝叶片，避开叶脉和病斑，剪取平整叶片固定于玻璃板上，轻轻抚平叶片后置于分析仪上。待测液用纯水稀释100 倍，利用微量进样器吸取稀释液，每次5 μL 滴加在叶片上。利用影像分析法拍照并测量接触角，重复测定10 次，取平均值。

1.2.6.2 静态表面张力的测定 使用铂金环法[20]，在 (25 ± 1) ℃下，将待测液用纯水稀释100 倍后进行测试，使用0.3 mm 的铂金环 (外径20.30 mm，周长61.89 mm，密度0.998 g/mL)，在测定前使用纯水对界面张力值进行校准，校准后待铂金环浸入液面5 mm 以下开始测量，误差范围为 ±1 mN/m。重复测定3 次，取平均值。

1.2.6.3 动态表面张力的测定 采用最大气泡压力法测定药液用纯水稀释100 倍后的动态表面张力。测定前使用纯水进行校准，其中，毛细管半径为0.345 mm，温度25 ℃，测定气泡表面寿命范围10～10 000 ms。待测样品在 (25 ± 1) ℃下进行处理。

2 结果与分析

2.1 羌活提取物中活性成分羌活醇的含量

利用外标法绘制羌活醇工作曲线，以羌活醇峰面积积分值(y)为纵坐标，质量浓度(x)为横坐标，计算回归方程为：y= 47058.19835x+ 876.85022，决定系数R2= 0.999。

结果如图1 所示，羌活醇出现在33.23 min，峰面积21131.4，经计算分析可知，羌活提取物中羌活醇的质量浓度为0.43 mg/mL，对应羌活提取物中羌活醇的质量分数为2.25%。值得注意的是，在保留时间33.80 min 左右出现一个比例较大的组分，经文献调研确认其为异欧前胡素[21-23]，鉴于在《中国药典》中对羌活中的异欧前胡素含量未做要求，故本研究中将羌活醇作为羌活标志性成分。

图1 羌活提取物中羌活醇高效液相色谱分析Fig. 1 HPLC chromatogram of notopterol extracted from Notopterygii Rhizoma et Radix

2.2 溶剂筛选

羌活提取物是一种不溶于水的粘稠浸膏，选择合适的溶剂是制备微乳剂的重要条件。本研究结果显示，除用二甲苯溶解后有残渣外，其余溶剂均能使提取物完全溶解，且甲醇、乙醇、乙酸乙酯的溶解性优于环己酮和异丙醇。然而，单独使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和异丙醇作为溶剂时，乳化剂的乳化效果较差，导致原药溶解度下降，溶液易分层。而以环己酮为溶剂时，乳化效果较好。甲醇为中等毒性，其他均为低毒或微毒。综合考虑乳化效果与溶剂毒性，最终选用环己酮为溶剂、乙醇为助溶剂和防冻剂来制备羌活提取物微乳剂。

2.3 原药用量筛选

结果 (表2) 表明，当原药质量分数为15%时，溶液体系的稳定性均符合微乳剂剂型指标，有效成分降解率 (4.34%) 较低，因此在微乳剂制备中选择原药质量分数为15%。

表2 羌活提取物原药含量对微乳剂稳定性影响Table 2 The effects of Notopterygii Rhizoma et Radix extract content on the stability of microemulsion

2.4 溶剂用量筛选

由表3 可知，当溶剂环己酮质量分数为9%时，体系稳定性较好且有效成分降解率符合要求。

表3 溶剂环己酮含量对微乳剂稳定性影响Table 3 The effects of solvent cyclohexanone content on the stability of microemulsion

2.5 乳化剂用量筛选

由表4 数据可以看出，当乳化剂HMK-2100质量分数在16%～20%时乳化效果较好，体系较为稳定，均可得到深褐色透明均一的微乳剂，为降低成本，选择乳化剂质量分数为16%。

表4 乳化剂HMK-2100 含量对微乳剂稳定性影响Table 4 The effects of emulsifier HMK-2100 content on the stability of microemulsion

2.6 羌活提取物微乳剂最优配方确定及其理化性质

综合上述筛选条件，确定羌活提取物微乳剂最优配方(质量分数)如下：15%羌活提取物，9%环己酮(溶剂)，16%HMK-2100 (乳化剂)，10%乙醇(助溶剂)，0.1%AF1506 (消泡剂)及49.9%纯水。对15%羌活提取物微乳剂及30%羌活提取物乳油按照各自的国家标准进行质量指标测定。结果如表5 所示，制备所得微乳剂和乳油各项指标均符合要求，均具备良好的外观和质量。

表5 不同剂型配方的理化参数Table 5 Physical and chemical parameters of different formulations

2.7 对植物病原菌的抑制作用

抑菌活性测定结果 (表6) 表明：5%羌活提取物微乳剂、15%羌活提取物微乳剂及30%羌活提取物乳油对供试植物病原菌均具有明显的抑制作用，且抑菌率随药剂质量浓度的增加而增大。在500 mg/L (羌活醇质量浓度为11.25 mg/L) 时，针对辣椒疫霉、水稻稻瘟和水稻纹枯病原菌，15%微乳剂的抑菌效果均优于5%微乳剂。对比15%羌活提取物微乳剂及30%羌活提取物乳油，尽管在有效成分质量浓度相同时两者的抑菌效果相差不大，但微乳剂中有机溶剂的使用量大幅减少，且微乳剂粒径在纳米级别[24]，药物在传递过程中利用率更高。

表6 不同羌活提取物剂型对植物病原真菌的抑制效果Table 6 The inhibitory effects of different formulations of Notopterygii Rhizoma et Radix extract on plant pathogenic fungi

由表6 可知，15%羌活提取物微乳剂在3 种不同的施药浓度下对4 种植物病原菌均具有较好的抑制作用，其中在300 mg/L (羌活醇质量浓度为6.75 mg/L) 时，对水稻纹枯病菌和水稻稻瘟病菌的抑制率接近或达到100%。尽管在同等施药剂量下，羌活提取物微乳剂的抑菌效果与化学类杀菌剂噻呋酰胺及多菌灵还存在一定的差距，但因前者具有较高的生物安全性而具备较大的发展潜力。

2.8 羌活提取物微乳剂的应用性能测试结果

2.8.1 接触角 有研究表明，雨水可以在辣椒叶片表面形成弧形或半圆形水滴而润湿植物，但不能润湿疏水型植物水稻和小麦。绿萝叶片因具有褶皱的表面可作为疏水型植物的典型代表[25]，因而在新鲜洁净的绿萝叶片表面进行药液应用性能测试具有一定代表性。测试结果(图2)表明，室温下15%羌活提取物微乳剂100 倍稀释液在绿萝叶片表面的接触角为52.6° ，根据表面化学的一般原理[26-27]，当θ< 60° 时，表示药液的亲水性强，液滴在植物表面应具有较好的铺展性和润湿性。

图2 15%羌活提取物微乳剂100 倍稀释液在绿萝同一叶片不同位置处的接触角Fig. 2 Contact angle of Notopterygii Rhizoma et Radix extract 15% ME 100-time dilution at different positions on the same leaf of green dill

2.8.2 静态表面张力测试 经测试，15% 羌活提取物微乳剂稀释100 倍后药液的表面张力约为32.95 mN/m，查阅文献可知，新鲜水稻叶片和小麦叶片的临界表面张力分别为36.70 和36.90 mN/m，辣椒叶片临界表面张力值在43.38～45.27 mN/m 之间[28]，15%羌活提取物微乳剂稀释液的表面张力与小麦、水稻、辣椒叶片的临界表面张力值相近，因此推测15%羌活提取物微乳剂在使用过程中，在小麦、水稻及辣椒叶片表面应具有良好的润湿铺展效果。

2.8.3 动态表面张力测试 由图3 可知，15%羌活提取物微乳剂经纯水稀释100 倍后，表面张力随表面年龄增加而显著减小，在8000 ms 内表面张力降低了约25.57 mN/m。由于动态表面张力是时间的函数，其大小由溶液中的表面活性剂传递到新鲜表面的速率和表面吸附量大小决定[29]。一般来说，稀释后药液的表面张力越小，液滴越易附着在叶片表面，进而可显著提高药液沉积量。由此推测所制备的微乳剂可以在植物叶片表面进行良好的润湿铺展。

图3 15%羌活提取物微乳剂100 倍稀释液的动态表面张力Fig. 3 The dynamic surface tension of 100 times diluted solution of Notopterygii Rhizoma et Radix extract 15% ME

3 结论

利用羌活提取物分别制备了15%羌活提取物(羌活醇0.34%) 微乳剂、5%羌活提取物 (羌活醇0.11%) 微乳剂和30%羌活提取物 (羌活醇0.68%)乳油，并对15%羌活提取物微乳剂的配方进行了筛选。比较分析了3 种制剂对4 种植物病原菌的抑制效果。结果显示：在有效成分质量浓度相同时，与5%羌活提取物微乳剂相比，15%羌活提取物微乳剂的抑菌效果更好，且具有更为优异的应用性能；与30%羌活提取物乳油相比，15%羌活提取物微乳剂在相同质量浓度下的抑菌效果相当，但微乳剂中有机溶剂用量大幅减少，成本显著降低。15%羌活提取物微乳剂的理化性质等指标均符合国家标准；稀释100 倍溶液在绿萝叶片接触角小于60°，静态表面张力为32.95 mN/m，动态表面张力在一定时间内可快速下降，故稀释液在叶片表面具有较好的铺展性和润湿性；稀释500 倍 (羌活提取物质量浓度为300 mg/L，羌活醇质量浓度为6.75 mg/L) 后，对水稻稻瘟和水稻纹枯病菌抑制率仍保持在90%以上，对水稻稻瘟和水稻纹枯病菌具有较强抑制作用。