基于网络药理学和免疫浸润的大蒜素对肝细胞癌作用机制分析

董雪静，朱 华，王 颖

（广西中医药大学科学实验中心，南宁 530200）

原发性肝癌（Primary Liver Cancer，PLC）包括肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）、肝内胆管癌（Intrahepatic Cholangiocarcinoma，ICC）和其他罕见类型［1］，其中HCC 最为常见，约占90%［2］。HCC 起源于肝细胞，常见的引发原因是氧化应激、炎症和其他潜在的肝病［3］。国际癌症研究机构（IARC）2018年的数据显示，目前肝癌的死亡率在所有癌症死亡率中排名第四位，发生率排名第六位［4］。每年全球新发肝癌患者超过80 万例，死亡患者超过78 万例［5］，预计未来10 年新增病例会持续增加［6］。

大蒜素是从百合科葱属植物大蒜鳞茎中提取的含硫化合物，主要成分为二烯丙基二硫化物（Diallyl disulfide，DADS）和二烯丙基三硫化物（Diallyl trisulfide，DATS）［7］，具有抗肿瘤、降血压、抗细菌、提高免疫等多种作用。虽然有关大蒜素的药理机制及临床应用研究不断出现，但其与肝癌的分子作用机制尚未明确。

近年来兴起的网络药理学，融合了系统生物学、多向药理学、计算机技术等多学科的技术［8］，基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，揭示多分子协同作用于人体的规律及机制。这种从多靶点角度出发探索疾病与药物之间相关性的方法，与传统中医药的整体观念和辨证论治相符［9］。本研究采用网络药理学的方法，对大蒜素作用靶点和HCC 相关的疾病靶点进行筛选，构建大蒜素与HCC 相互作用的网络关系，通过生物信息学分析结合生存分析和免疫浸润力求深入揭示二者的相互作用机制。

1 材料与方法

1.1 大蒜素化学成分靶点的收集与筛选

利用TCMSP 数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/）检索大蒜素的有效成分信息，下载并保存为mol2 格式文件。将TCMSP 中筛选出的大蒜素化学成分分子结构以mol2 格式上传至PharmMapper 数据库（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/），基于反向药效团匹配法筛选药物的药效团模型，勾选Human Protein Targets Only，设置最大生成300 个蛋白构象，得到与大蒜素相关的靶点名称、Fit score 等信息。

1.2 大蒜素有效成分靶点蛋白互作（PPI）网络的构建

为探索靶点蛋白之间的相互作用，将“1.1”得到的大蒜素潜在靶点信息导入蛋白相互作用数据库STRING11.0（https：//string-db.org/），研究物种设为人类，得到蛋白互作关系。将STRING11.0 数据库中导出的文件，利用Cytoscape3.7.1 软件进行可视化分析，调节网络节点、边等属性，最终得到PPI 网络图。其中，节点代表有效成分或疾病靶点，边代表有效成分与疾病靶点相关联［10］。节点度表示与某一成分相连靶点的个数，数值越大，说明与该成分相关疾病靶点越多，其发挥治疗作用越大。

1.3 HCC 相关靶点的收集

利 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库收集与HCC 相关的靶点。按相关度由大到小排列，取前300 个靶点。GeneCards［11］是一个综合性的数据库，包括人类基因（GeneCards）、人类疾病（MalaCards）、人类通路（PathCards）等数据库，能够提供简明的基因组、蛋白质组、遗传等人类基因数据，为基因疾病领域内的生物医学发现提供丰富资源。

1.4 大蒜素对HCC 潜在作用靶点的收集

将“1.2”中从STRING11.0 数据库导出文件中的node1 和node2 两列靶点蛋白进行整合，筛去重复靶点，并与“1.3”中收集的300 个HCC 相关靶点，利用

Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）工具进行交集比对，最终获得大蒜素治疗HCC 的潜在作用靶点。

1.5 潜在作用靶点的PPI网络和拓扑学分析

将“1.4”中获得的潜在作用靶点导入STRING11.0 数据库，设定物种为人类，得到蛋白互作关系，导出为TSV 格式，再运用Cytoscape3.7.1 软件进行可视化分析。

1.6 潜在作用靶点的表达及生存预后分析

将“1.4”中获得的潜在靶点导入GEPIA 数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/），癌症名称选择LIHC，绘制基因表达图和生存分析图。GEPIA［12］是一个基于Web 的工具，可以基于TCGA 和GTEx 数据库提供交互式和可自定义功能，包括差异表达分析、轮廓图绘制、患者存活率分析、相似基因检测等。

1.7 肿瘤细胞免疫浸润分析

将“1.6”中得到的具有统计学意义（P＜0.05）的基因导入TIMER 数据库（http：//cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER/），得到其与肿瘤微环境中免疫细胞浸润的关系。TIMER［13］是一个交互式的数据库，运用其独特的反卷积方法，可以全面灵活地从基因表达谱中推断TIIC 的丰富度。通过Spearman 的相关性和统计学显著性评价基因表达的相关性，并通过以下绝对值指南确定相关性的强弱：0～0.19 表示非常弱，0.20～0.39 表示弱，0.40～0.59 表示中等，0.60～0.79 表示强，0.80～1.00 表示非常强［14］。

2 结果与分析

2.1 大蒜素的化学结构及其潜在靶点信息

根据PharmMapper 数据库以及文献查找大蒜素已报道的靶点，剔除非人源靶点，最终得到大蒜素的潜在靶点194 个，其中包括FABP3、GSTA1、MAPK8、MMP3、CASP1 等。大蒜素的靶点相互作用如图1 所示。关系网络中靶点详细信息见表1，表中仅列出度值最高的前30 个靶点。

表1 大蒜素蛋白互作拓扑学分析（度值排序前30 位）

图1 大蒜素蛋白互作网络

2.2 HCC 相关靶点的预测与潜在治疗靶点的收集

在GeneCards 数据库中共筛选出4 781 个基因，根据相关度由大到小取前300 个靶点。将“2.1”得到的大蒜素的194 个靶点与HCC 发病机制的300 个靶点利用Venny2.1.0 进行映射，得到共同靶点31 个，包 括CCNA2、BCL2L1、MAPK8、CASP3、PARP1、ESR1、MMP9 等。大蒜素成分靶点与HCC 相关发病机制靶点韦恩图如图2 所示。

图2 大蒜素成分靶点与HCC 相关发病机制靶点韦恩图

2.3 大蒜素对HCC 作用靶点的拓扑学分析

为了更直观地表示潜在治疗靶点间的相互关系，将31 个潜在靶点导入STRING11.0 数据库构建PPI 网络关系，如图3 所示，将得到的蛋白互作网络导入Cytoscape3.7.1 软件进行拓扑学分析。经Network Analyzer 分析发现，平均最短路径长度在1.100～2.000，平均度值为16.45，平均介数为0.016，平均聚类系数为0.75（表2）。网络分析中介数值和度值是2 个重要参考指标［15］，介数值越大，度值越高，说明该点越有可能是治疗HCC 的关键靶点。

表2 大蒜素对HCC 潜在作用靶点的拓扑学分析

图3 大蒜素对HCC 潜在作用靶点的蛋白互作关系

2.4 潜在作用靶点表达量的差异及生存分析

将31 个潜在靶点依次输入GEPIA 数据库，选择两组间方差分析，得到靶点在正常组织与HCC组织中表达水平的箱图（图4）。结果显示，31 个潜在靶点中有AURKA、CCNA2、MMP9、ESR14 个基因的P小于0.05，差异具有统计学意义。与正常组织（n=160）相比，CCNA2、AURKA、MMP93 个基因的表达量在HCC 组织中（n=369）显著升高，ESR1的表达量较低。继续将4 个基因导入GEPIA 数据库，绘制Kaplan-Meier 曲线，进一步分析4 个基因的表达情况对HCC 患者干预后的影响（图5）。各组的P均小于0.05，差异有统计学意义，说明CCNA2、AURKA、MMP9、ESR14 个基因的表达对HCC 患者的干预后有影响。

图4 靶点在正常组织和HCC 组织中的相对表达量差异

图5 4 个基因的表达量与HCC 患者的干预后关系

2.5 肿瘤细胞免疫浸润分析

将CCNA2、AURKA、MMP9、ESR14 个基因导入TIMER 数据库，评估其表达与免疫浸润水平的相关 性。AURKA的 表 达 与B 细 胞（r= 0.424，P=2.01e-16）、CD8+T 细 胞（r= 0.258，P=1.31e-06）、CD4+T 细 胞（r=0.135，P=1.24e-02）、巨 噬 细 胞（r= 0.301，P=1.42e-08）、中性粒细胞（r= 0.308，P= 4.99e-09）和树突细胞（r= 0.340，P= 1.18e-10）的浸润水平呈正相关，如图6A 所示。

CCNA2的表达与HCC 中B 细胞（r= 0.476，P=7.31e-21）、CD8+T 细胞（r= 0.354，P= 1.63e-11）、CD4+T 细胞（r= 0.318，P= 1.60e-09）、巨噬细胞（r=0.402，P=1.21e-14）、中性粒细胞（r=0.366，P=2.41e-12）、树突细胞（r= 0.489，P= 8.02e-22）的浸润水平呈明显的正相关，如图6B 所示。

ESR1的表达与HCC 中B 细胞（r= -0.216，P=5.22e-05）、CD8+T 细 胞（r= -0.060，P=2.69e-01）、CD4+T 细胞（r= -0.044，P=4.16e-01）、巨噬细胞（r= -0.129，P=1.68e-02）、中性粒细胞（r=-0.039，P=4.71e-01）、树突细胞（r=-0.080，P=1.39e-01）的浸润水平呈负相关，如图6C 所示。

MMP9的表达与HCC 中B 细胞（r= 0.529，P=3.05e-26）、CD8+T 细 胞（r=0.421，P= 4.13e-16）、CD4+T 细胞（r= 0.356，P=9.68e-12）、巨噬细胞（r=0.473，P=2.12e-20）、中性粒 细胞（r=0.340，P=8.96e-11）和树突细胞（r= 0.584，P=1.72e-32）的浸润水平呈正相关，如图6D 所示。

图6 4 个基因的表达与HCC 中免疫浸润水平的相关性

3 讨论

HCC 是一种独特的癌症，通常发生在慢性肝病的背景下，其发生率取决于宿主、疾病和环境因素之间复杂的相互作用，其主要危险因素是慢性感染乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）、黄曲霉毒素B1污染的食品、大量饮酒、肥胖和Ⅱ型糖尿病等［16-19］。虽然普遍接种HBV 疫苗大大降低了HBV的感染率［20］，但其他因素导致的HCC 还未得到有效的治疗方法。试验研究发现，大蒜素具有良好的抗癌、防癌作用，可以通过增强巨噬细胞的抗肿瘤作用，提高肿瘤患者的细胞免疫功能［21］。本研究利用网络药理学的方法，借助TCMSP、PharmMapper、GeneCards、STRING11.0、Venny2.1.0 等数据库，富集得到大蒜素作用于HCC 的31 个潜在靶点。对31 个靶点进行表达量分析和生存分析，得到4 个P小于0.05 的靶点，又进行细胞免疫浸润分析。

生存 分析 的KM 曲 线 显示，CCNA2、AURKA、MMP9、ESR14 个基因的表达对HCC 患者的预后均有影响，各组P均小于0.05，差异有统计学意义，可以认为大蒜素可能通过这4 个靶点对HCC 发生作用。肿瘤浸润淋巴细胞是癌前哨淋巴结状态和生存率的独立预测因子［22］。根据Spearman 的相关性和统计学显著性评价指南，AURKA的表达水平与B 细胞的浸润水平之间存在中度的正相关，CCNA2的表达水平与B 细胞、巨噬细胞以及树突细胞的浸润水平之间存在中度的正相关，MMP9的表达水平与B细胞、巨噬细胞以及树突细胞的浸润水平之间存在中度的正相关。CCNA2属于细胞周期蛋白A2 家族，参与细胞周期的转换，在人体多种组织中都有表达，且在癌症组织中表达增多［23］。Kim 等［24］通过研究发现，CCNA2转录起始位点的遗传变异与肺癌、肝细胞癌和结肠直肠癌的风险显著增加，但与乳腺癌或胃癌的风险没有明显关系，表明CCNA2对人类癌症发展的遗传变异可能具有组织特异性。Sakamoto等［25］通过RT-PCR（半定量逆转录聚合酶链反应）检测发现，肿瘤组织中的MMP9mRNA 表达水平高于非肿瘤组织，提示肿瘤组织中MMP9的表达可能与小肝细胞癌的发展有关，可能促进HCC 的早期生长。雌激素受体1（ESR1）可以通过免疫应答参与免疫调节［26］。Okasha 等［27］的研究表明，雌激素能够影响CD4+T 细胞和CD8+T 细胞的产生，并且在体内诱导T 细胞凋亡。HNF-4a 是控制肝细胞代谢和分化以及正常肝结构发育的关键因素［28］。Wang 等［29］通过研究发现，ESR1可以通过阻断HNF-4a 与HBV 增强剂的结合，削弱HBV 转录，从而减缓慢性肝病发展。

综上所述，本研究利用网络药理学的方法，结合细胞生存及免疫浸润分析，初步探讨了大蒜素多靶点、多通路治疗HCC 的可能作用机制，筛选出大蒜素治疗HCC 可能涉及的干预后相关基因，这些干预后相关基因可以作为潜在的生物标志物，为后续的试验研究提供指导，但由于网络药理学技术的局限性以及其他因素影响，具体作用机制还需要后续更多针对性的试验加以验证。