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振动运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌FOXO1、GLUT4蛋白表达的影响

2022-06-13于玲王晶刘影刘涛

锦州医科大学学报 2022年2期
关键词:骨骼肌振动蛋白

于玲,王晶,刘影,刘涛

(1.锦州医科大学药学院;2.锦州医科大学附属第一医院;3.锦州医科大学护理学院,辽宁 锦州 121000)

2型糖尿病(diabetes mellitus,T2DM)是一种代谢性疾病,以血糖升高、胰岛素抵抗、血脂紊乱为其主要表现。其形成原因与胰岛素抵抗和胰岛细胞受损有关。胰岛素抵抗是指胰岛素靶器官(肝脏、脂肪、骨骼肌等)对胰岛素不敏感,主要体现在骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的摄取能力变弱,存储能力降低,肝脏中葡糖糖输出增多,致使胰腺要分泌更多的胰岛素来维持机体的正常代谢。当代偿无法进行时机体的血糖就不能恢复到正常水平,形成2型糖尿病。世界糖尿病联盟公布的数据显示,2019年全球糖尿病患者有4.63亿人,中国糖尿病患者约为1.164亿人,预计到2040年中国糖尿病患者人数将达到1.51亿人,糖尿病的防治形势更加严重[1]。

运动疗法作为糖尿病预防与治疗的有效手段,一直以来非常受重视,如袁李佳龙[2]等研究显示适当游泳运动能够使2型糖尿病大鼠损伤的骨骼肌有所改善。张新霞[3]等研究显示适度的中等强度的跑台运动能够缓解糖尿病大鼠骨骼肌的病理损伤。振动运动是通过机械振动来引起肌肉收缩的方法[4],是一种不受患者意识支配的被动运动方式,能够在短时间内达到与传统运动同样的效果,能够增加患者对运动的依从性。振动运动在糖尿病预防与减轻其并发症方面有一定的研究。有研究显示振动运动能够降低血糖,改善胰岛素抵抗,振动运动联合药物能够减轻二型糖尿病肝脏的损伤[5-6]。本研究主要探讨振动运动对2型糖尿病糖脂代谢、骨骼肌FOXO1和GLUT4蛋白表达,对骨骼肌病理损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、总胆固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三酯(tri-glyceride,TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)试剂盒(南京建成生物);链脲佐菌素(Sigma公司);BCA蛋白试剂盒(北京鼎国昌盛生物科技有限公司);血糖仪(美国强生公司);全自动生化仪(日本日立公司);显微镜(日本Nikon公司);电磁吸合式振动台(广州凡正电磁振动机厂);AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);SD大鼠,雄性,(6~8)w,体重(200±20)g,来自锦州医科大学动物中心。

1.2 方法

1.2.1 2型糖尿病糖模型的制备

取雄性SD大鼠,适应性喂养1 w,普通饲料喂养正常对照组大鼠,高脂高糖饲料[7](饲料配方:66.5%基础维持饲料、2.5%胆固醇、10%猪油、1%胆酸盐、20%蔗糖)喂养糖尿病模型组,每组均喂养8 w。将链脲佐菌素溶解在pH值为3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,临用前在超净台中用0.22 μm无菌滤膜过滤。2型糖尿病糖组一次性腹腔注射小剂量(25 mg/kg)链脲佐菌素,损伤大鼠部分胰腺组织诱发2型糖尿病糖模型,72 h后测血糖,连续检测3 d,血糖平稳后,选取血糖值>11.1 mmol/L的大鼠为2型糖尿病模型大鼠。正常对照组给予同体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

1.2.2 分组及运动方式[8]

将2型糖尿病模型大鼠随机分成模型组、高频(35 Hz)振动组、中频(25 Hz)振动组和低频(15 Hz)振动组,每组7只。各组的振幅峰峰值均为3 mm,振动运动时间为15分钟/次,每天早晚各运动1次,每周运动6 d,为期8 w。运动方式是垂直振动,最大位移为52 mm,工作频率0.5~600 Hz。振动台上放置由9个长方体方格组成的自制玻璃支架,距离振动台面1 cm,将大鼠放入方格内,大鼠只能站立,这样下肢就能直接接触振动台将振动传到到全身。糖尿病组和振动运动组给予高脂高糖饲料,正常对照组给与普通饲料,饮水均自由进食。

1.2.3 样本收集

分别于实验开始的第0、2、4、6、8周检测FBG;实验结束前,大鼠禁食12 h,用10%乌拉坦按10 mL/kg的剂量麻醉,眼眶取血,离心,留存血清用于生化指标测定。实验结束后处死,取大鼠小块骨骼肌置于4%多聚甲醛溶液中固定,HE染色观察;将剩余骨骼肌置于-80 ℃冰箱内,备用于测定GLUT4、FOXO1和DK4蛋白表达。

1.2.4 生物化学指标测定

氧化酶法,全自动生化分析仪检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白总胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白总胆固醇(HDL-C)。

1.2.5 炎症因子的测定

ELISA法检测大鼠血清中炎症因子IL-6、TNF-α含量。

1.2.6 氧化应激反应相关物质

使用黄嘌呤氧化酶法测定大鼠骨骼肌中SOD 的活性;使用硫代巴比妥酸法检测大鼠骨骼肌中MAD含量。

1.2.7 骨骼肌组织HE染色

骨骼肌组织经4%多聚甲醛溶液固定48 h后,70%乙醇脱水8 h,80%乙醇脱水过夜,90%乙醇脱水1次,95%乙醇脱水2次,100%乙醇脱水2次,二甲苯透明2次,浸蜡2次,将组织包埋于蜡块中。取包好的组织块切片,厚度为5 μm,二甲苯脱蜡,乙醇脱苯,PBS洗脱2次,苏木精、伊红染色;再经不同浓度乙醇洗脱、二甲苯透明、中性树胶封片后,用光学显微镜观察各组骨骼肌组织病理学改变。

1.2.8 FOXO1、GLUT4蛋白表达检测

Westerm blot法检测,取部分骨骼肌组织用细胞超声粉碎机粉碎,加入一定量的裂解液,静止30 min,12 000 prm离心15 min,取上清液为组织总蛋白,蛋白浓度用BCA法进行测定,根据测定的样品蛋白浓度,校正蛋白质上样量,尽量保持样品蛋白含量的均一性。每组样品在上样前加入不同体积的上样缓冲液loading buffer,在沸水中煮沸5 min,使蛋白质变性。配置分离胶与浓缩胶,插入齿梳,待浓缩胶凝固后,放入电泳槽,加入电泳缓冲液,所有样品和蛋白标准物上样量均为20 μL,电压设为90 V,开始聚丙烯酰胺凝胶电泳,观察Maker蛋白的分离状况,终止电泳。用硝酸纤维素(PVDF)膜膜干法转膜20 min,转膜电压100 V,用5%脱脂奶粉室温封闭1 h,根据标准蛋白不同的分子量对膜进行切割,取含目标蛋白的PVDF膜与稀释过的一抗4 ℃杂交过夜,用 TBST 洗膜3次,与二抗4 ℃反应2 h,再次用TBST洗膜3次,加 ECL显色,然后置仪器暗盒中成像,最后经凝胶自动分析成像系统与ImageJ 图像分析软件对图印迹区带定量分析。

1.3 统计学方法

用SPSS 21.0进行统计学分析,数据以均数±标准差表示,对数据进行单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 振动运动对2型糖尿病大鼠空腹血糖影响

与正常组(4.38±0.097)比较,模型组大鼠(19.4±0.913)空腹血糖明显升高,振动运动8 w后,振动运动组血糖均下降,高频率振动组(15.7±2.79)和中频振动组(16.6±1.72)空腹血糖下降明显,说明振动运动能够降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖,见图1。

图1 不同运动时间大鼠血糖的变化

2.2 振动运动对2型糖尿病大鼠体重、TG、TC、LDL-C、HDL-C的影响

与正常组比较,模型组TG、TC、LDL-C均升高(P<0.05),HDL-C下降(P<0.05);振动运动8 w后与模型组比较,高频振动组和中频振动运动组大鼠TG、TC、LDL-C均降低,结果有统计学意义(P<0.05),但高频振动运动组降低更加明显。低频振动运动组TG、TC、LDL-C检测结果与模型组比较同样降低但没有统计学差异。与模型组比较高频率振动组和中频振动运动组大鼠HDL-C升高,结果有统计学意义(P<0.05),高频振动运动组显著升高,低频运动组与模型组比较HDL-C升高,结果无统计学差异;2型糖尿病模型大鼠8 w后明显消瘦,出现典型的“三多一少”症状,与正常对照组比较体重明显下降(P<0.05),各振动运动组与模型组比较体重明显增加(P<0.05),见表1。

2.3 振动运动对2型糖尿病大鼠IL-6、TNF-α的影响

与正常对照组比较,8 w后模型组IL-6、TNF-α均升高(P<0.05),说明在2型糖尿病发展过程中存在炎症损伤。振动运动8 w后,与模型组比较,高频振动组和中频振动组IL-6、TNF-α均降低,结果均有统计学意义(P<0.05),高频振动组明显改善2型糖尿病的炎症损伤。低频振动组与模型组比较IL-6、TNF-α均降低,结果无统计学差异,见表2。

表1 振动运动对体重、TG、TC、LDL-C、HDL-C的影响

表2 振动运动对IL-6、TNF-α的影响

2.4 振动运动对2型糖尿病大鼠SOD 、MAD、的影响

与正常对照组比较,8 w后2型糖尿病模型组MAD升高明显(P<0.05),SOD下降明显(P<0.05),说明2型糖尿病进展过程中出现氧化应激反应。振动运动8 w后,与模型组比较,高频振动组和中频振动组大鼠MAD降低,SOD升高,说明高频振动能够降低2型糖尿病的氧化应激反应,减轻对骨骼肌的损伤。结果有统计学意义(P<0.05),低频振动组MAD、SOD没有统计学差异,见表3。

2.5 振动运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌的影响

正常组骨骼肌肌纤维排列正常,肌细胞排列紧密,细胞核均位于细胞边缘,肌纤维周期性横纹排列规律;2型糖尿病模型组大鼠骨骼肌部分肌纤维变形弯曲,肌细胞排列疏松,肌细胞核溶解、固缩;高频率振动组大鼠骨骼肌细胞排列较为紧密,肌纤维周期性横纹排列较为规律,见图2。

表3 振动运动对2型糖尿病大鼠SOD、MAD的影响

图2 振动运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌的影响

2.6 免疫印迹结果

Western blot法结果显示,与正常对照组比较,模型组大鼠骨骼肌FOXO1、PDK4蛋白表达显著升高(P<0.05),GLUT4蛋白表达显著下降(P<0.05);8 w振动运动结束后,与模型组比较,高频振动组和中频振动组大鼠FOXO1、PDK4蛋白表达均降低,结果有统计学意义(P<0.05),其中以高频振动组下降显著,在振动运动组GLUT4表达升高,高频振动组和中频振动组结果有统计学意义(P<0.05),其中高频振动组升高明显,见图3。

A:正常组;B:L糖尿病模型组;C:高频率振动运动组;D:中频率振动运动组;E:低频率振动运动组。*与正常组比较(P<0.05);#与模型组比较(P<0.05)

3 讨 论

糖尿病是内分泌代谢性疾病,以血糖升高为主要特征,后期可产生眼、肾、神经、心脏和血管等多系统损害。鉴于糖尿病并发症对机体的严重损害,糖尿病的治疗应在早期进行干预。在糖尿病的病程中骨骼肌功能的损害受到越来越多的关注。振动运动是一种通过机械振动引起直立者下肢骨骼肌振动的运动方式。其原理是在振动下,每个肌肉细胞被激活,进行持续的收缩;整个肌肉收缩更快,使动作变得更灵敏;振动运动针对提高下肢的力量、耐力更为有效。

本研究采用了为期8 w的振动运动干预方法,使大鼠保持直立,下肢直接接触振动台表面实现全身振动。实验结果显示,与正常组比较模型组大鼠体重下降,逐渐消瘦,精神萎靡,糖脂代谢紊乱严重;振动运动组大鼠体重降低较小,糖脂代谢紊乱改善。与模型组相比,高频率和中频率振动组能够显著降低血糖和血脂,低频率振动组则无明显效果。

2型糖尿病的发病机制与慢性炎症和免疫系统的激活相关联[9],脂肪组织、肝脏、肌肉和胰腺本身就是2型糖尿病的炎症部位,容易产生大量促炎性细胞因子如TNF-α、IL-6等,并有巨噬细胞和T淋巴细胞的浸润,免疫细胞群从对抗炎症向促进炎症发展转变。抗炎疗法在2型糖尿病的预防和治疗中占有一席之地。本研究结果显示高频和中频振动运动后血清中的TNF-α、IL- 6明显下降,说明这种运动方式能够降低2型糖尿病大鼠体内的炎症反应。

大量的研究结果表明2型糖尿病的发展与机体的氧化应激相关[10-11]。超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内存在的一种抗氧化金属酶,它能够通过催化作用使超氧阴离子自由基歧化清除,能够有效的调节机体氧化和抗氧化的平衡。MDA为过氧化反应的代谢产物,能够直接反应血浆中氧自由基量的变化。因此SOD 和 MAD 的含量可以反映机体氧化应激的强烈程度。本研究结果表明,在模型组大鼠血清中 MDA含量升高,SOD活性下降,反映出在2型糖尿病发展时机体处于氧化应激状态[12]。高频和中频振动运动后,SOD活性升高,MDA的含量明显下降。说明振动运动能够缓解骨骼肌的氧化应激状态。

FOXO1是叉头框O类蛋白家族一类重要的转录因子[13]。FOXO1广泛存在真核生物中,其活性受到基因表达水平、蛋白质之间的相互作用、翻译后的修饰等多方面的调控[14]。大量研究表明 FOXO1在2型糖尿病的胰岛素抵抗、糖脂代谢等过程中起到重要作用[15]。PDK4是 FOXO1的下游靶基因,能够调控糖酵解和糖异生途径。2型糖尿病状态骨骼肌中 FOXO1、PDK4蛋白表达均增加,过表达的后果是葡萄糖氧化受到限制。本实验结果显示振动运动能够降低FOXO1、PDK4蛋白表达,缓解骨骼肌的病理损伤。

综上所述,本实验研究重点考察振动运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌的影响,从实验结果来看高频振动运动能够降低大鼠的空腹血糖,改善高血脂状态,减轻机体的炎症反应和骨骼肌的氧化应激,降低FOXO1、PDK4蛋白表达,延缓2型糖尿病骨骼肌的损伤。从而为2型糖尿病临床预防与治疗提供理论依据。

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