杜洛克公猪精液中微凝块对保存效果的影响

秦佳丽，曹婷婷,，孙敬帅，周 健，李智丽，高彬文，赵云翔,*

（1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528000；2.广西扬翔股份有限公司，广西贵港 537000；3.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450000）

评价公猪精液品质的指标包括精液活力、前向运动、畸形率等，这些指标与公猪的繁殖性能紧密相关。精子周围的环境和物质容易对精液保存质量产生较大影响，例如采精环境的卫生程度、采精流程是否达到无菌标准等都是决定精液质量的关键因素。此外，研究表明在精液中添加一些外源性抗氧化物质如白藜芦醇、褪黑素能够显著避免精子损伤，提高精子的运动能力和受精能力。但同时精液中存在的细菌等不良物质会造成精子凝集，严重损害精液质量。因此精子生存环境的研究对于完善公猪精液体外保存方法，提高公猪繁殖力具有重要意义。

目前在杜洛克精液中观察到微凝块存在，生产中往往将其视为精液中的杂质，并使用多层精液专用滤膜对含凝块较多的精液过滤，以避免可能带来的负面影响。但该凝块物在精液保存中的实际影响尚不清楚，故本文旨在探究杜洛克公猪精液中该凝块物存在对于精液保存中活力、前向运动能力、畸形率的影响，提供理论参考用以指导实际生产。

1 材料与方法

1.1 实验材料 计算机辅助精子分析（Computer-Aided Sperm Analysis，CASA）系统（Hamilton Thorne IVOS II）、猪精稀释粉（全能健Z，江苏中牧倍康药业有限公司）、17℃恒温箱、精液滤纸。

1.2 样品精液的采集 样品采集自扬翔某公猪站15 头健康杜洛克公猪的单次射精，使用手握法采集后立即送至实验室处理，使用计算机辅助分析系统对精液参数进行检测，活力>80 为合格。

1.3 精液处理方法 根据凝块状况将15 份精液分为无凝块组（n=7）和凝块组（n=8）。另取含凝块的稀释后精液经常温2 h 静置，取3 层精液专用滤纸（100 μm）根据纹理层与层间垂直叠放过滤以模拟生产中除去凝块的常规操作，设置为凝块过滤组（n=8），所有样品保存于17℃恒温箱。稀释调整精子密度为0.23 亿/mL。

1.4 凝块观察方法 取精液样品3 μL，加于八腔玻片，置于37℃加热板上预热2 min，使用CASA 系统镜头拍摄4 个视野对凝块进行形态和数量统计。随机选取来自凝块组8 个样品采精当天的图像，Image J 测量共计111 个凝块的最长直径；取凝块组、过滤组各样品4 个视野凝块数量之和表示每个样品的凝块数量。

1.5 精液检测方法 取精液样品3 μL，于八腔玻片，置于37℃加热板预热2 min，使用CASA 系统取4 个视野进行计算分析，记录活力、前向运动、正常形态3 项指标数值，其中畸形率计算公式为：畸形率=100-正常形态。以采精当天记作第0 天，每24 h 检测1 次，连续检测8 d。

1.6 统计分析 本实验使用Excel 2019 进行数据整理，通过IBM SPSS Statistics 26 进行数据分析，过滤前后凝块数量的差异分析使用配对检验；精液质量参数组间分析使用LSD 多重比较，时间点间以采精当天（第0 天）作为对照组，使用Dunnet 双侧检验进行分析。<0.05 表示差异显著，>0.05 表示差异不显著。

2 结果

2.1 凝块的形态和数量 通过对图像的观察和测量，凝块主要呈碎屑状，其最长直径范围为10～55 μm（图1）。对采精当天凝块组、凝块过滤组的凝块数量进行统计分析，结果显示过滤后凝块数量下降（<0.01）（图2）。

图1 精液中凝块的形态与大小

图2 凝块组与凝块过滤组的凝块数量

2.2 凝块对于杜洛克公猪精液活力的影响 由表1 可知，无凝块组、凝块组、凝块过滤组在采精当天的活力组间差异不显著，但凝块组精液活力在保存第5～7 天高于无凝块组（<0.05），在保存第5～6 天高于凝块过滤组（<0.01）。

表1 凝块对于杜洛克公猪精液活力的影响 %

此外，相较于各组采精当天的活力，无凝块组下降趋势最为明显，在第5 天显著下降，在第6、7 天具有极显著下降趋势；凝块过滤组次之，凝块组下降趋势最小，仅在第7 天具有显著下降趋势。

2.3 凝块对于杜洛克公猪精液前向运动的影响 由表2可知，在采精当天以及保存前3 d，无凝块组前向运动能力最佳；而在保存第4～7 天，凝块组的前向运动能力最佳，且显著高于过滤组。除第2 天外，凝块过滤组前向运动均为最低。

表2 凝块对于杜洛克公猪精液前向运动的影响 %

相较于各组采精当天的前向运动值，无凝块组的下降变化最为明显，凝块过滤组次之，凝块组变化最小，7 d 内没有发生显著性下降。

2.4 凝块对于杜洛克公猪精液畸形率的影响 由表3可知，无凝块组、凝块组、过滤组在采精当天的畸形率组差异不显著，但在保存中期（第2～5 天）无凝块组低于凝块组（<0.05）；除第7 天外凝块组始终保持最高的精液畸形率，所有检测数据均大幅低于畸形率生产标准（<20%）。

表3 凝块对于杜洛克公猪精液畸形率的影响 %

3 讨论

随着人工授精在猪生产业中的普及，精液的体外保存变得尤为重要。体外保存效果决定了优秀种公猪基因的传递范围，特别是对于作为杂交终端父本的杜洛克公猪更是意义重大。在精液保存中容易受到氧化损伤以及细菌污染的影响，导致精子运动能力下降。本实验结果表明存在凝块的杜洛克公猪精液在长期保存中更具优势，能够很好地维持精液活力和前向运动能力，这可能是由于凝块物在抗氧化或是抗菌方面发挥了一定作用。

精子畸形率是精子形态参数，反映其形态的受损情况。畸形精子包括头部畸形、颈部和中段畸形、主段畸形以及过多残留原生质，形成畸形精子的原因和机体感染、精索静脉曲张、遗传因素、环境因素等有关，畸形精子显著影响受精率甚至可能导致后代畸形。本实验中，凝块组的畸形率在保存中期与其他组存在显著差异，这可能是由于微凝块与精子的撞击在一定程度上加速了精子形态的损坏，导致畸形率升高这一过程提前。实际上在公猪精液生产中通常将20%的畸形率作为生产标准，本研究中3 组精液样品的畸形率在保存时间内均低于这一标准，说明凝块虽然加速了畸形率的升高但并没有对生产造成较大影响。

凝块直径的最大值与精子长度相近，是源于精浆的不溶物。公猪精浆中包含大量的水、果糖、蛋白质等物质。精浆蛋白种类十分丰富，在整个精卵结合过程中起精细调控的作用，其中包含参与形成粘蛋白，构成射精中凝胶状不溶物的精胶蛋白。精胶的大量存在会导致精液凝固，不利于精液体外保存，故采精时大量精胶蛋白被滤出，可能会存在直径小于滤网的蛋白碎片随精子被保留下来。精胶蛋白被证明具有抗菌活性，可与精子顶体蛋白形成复合物以阻止精子提前获能，使精子存活更久。源于精胶蛋白的多肽也被证明可以激活精子活力。基于此提出猜想：凝块物可能是源于公猪精浆中的精胶碎片，但具体成分为何还需要进一步的实验进行验证。

此外，本实验结果显示过滤会造成精液运动能力的下降，造成这一结果的原因可能与凝块的丢失有关，抑或是过滤对于精子造成机械性损伤。实际生产中应注意避免对于凝块的盲目过滤。

4 结论

本研究结果显示，精液凝块的存在对杜洛克公猪精液活力和前向运动能力无不利影响，可能来源于精液有益的精胶蛋白；生产中稀释后的静置过滤操作对精液活力和前向运动指标有较大的负面影响，应注意避免。