儋州鸡胸肌肉色性状全基因组关联分析

姜宏正，杨德智，马中华，荀文娟，侯冠彧，施力光*

（1.海南大学动物科技学院，海南海口 570228；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南海口 571101）

我国是禽肉生产大国，同时也是禽肉消费大国。据统计，我国肉类总产量中禽肉产量所占比重近30%，仅次于猪肉的产量。随着居民生活水平的提高，消费者对肉品质的需求也越来越高，肉色作为评价肉品质最直观的感官特征，已成为影响消费者购买的主要因素之一。因此，在选育种及养殖生产过程中，筛选出与动物肉色形成相关的候选基因或分子标记，对提高畜禽肉品质和经济价值有重要意义。全基因组关联研究（Genome-Wide Association Study，GWAS）能够检测到与目标性状相关的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）标记、基因组区域和候选基因，在畜禽育种工作中已取得显著效果。针对肉色性状的全基因组关联分析研究已经在猪、牛身上广泛开展。Wu 等对青峪猪群体进行GWAS 分析，发现MYC 靶基因1（MYC Target 1，）和BCL2 相互作用蛋白3（BCL2 Interacting Protein 3，）基因同时影响着青峪猪的pH 和肉色性状。Zhang 等利用全基因组关联分析对杂交猪的肉色性状进行研究，发现6 个基因组区域与杂交猪肉色性状相关。Luo 等研究发现泛素特异性肽酶43（Ubiquitin-Specific Peptidase 43，）是影响猪肉色性状的基因。Sun 等利用鸡60 K SNP 芯片对“北京油鸡×科宝肉鸡”F代资源群体的肉质性状进行全基因组关联分析，筛选出以I 型胶原蛋白A 2（Collagen Type I Alpha 2 Chain，）为代表的候选基因与肉色显著相关。然而，利用全基因组关联分析对地方特色鸡种肉色性状的研究报道较少。儋州鸡作为海南省特有的海岛型地方鸡遗传资源，具有肉质好、营养高等诸多优异种质特性，市场前景广阔，在儋州鸡产业化开发过程中，应用生物育种技术开展肉质性状的研究和相关分子标记的开发具有重要意义。本研究利用10×重测序技术获得的基因型数据对儋州鸡群体进行GWAS 研究，以期识别影响儋州鸡肉色性状的分子标记，探讨遗传标记的分布规律，寻找相关的候选基因，为儋州鸡选种育种及开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲养管理 随机选取600 只同一批次孵化的1 日龄儋州鸡（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供），按照《NY/T33-2004 鸡饲养标准》进行饲养。实验期分为育雏期（0～35 日龄）和育成期（35～90 日龄），基础日粮组成及营养成分见表1。

表1 实验日粮组成及营养水平（干物质基础）

1.2 样品采集和分析

1.2.1 血样采集及DNA 提取 60 日龄时，翅静脉采血5 mL，EDTA 抗凝处理，其中1 mL 使用动物血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取基因组DNA，紫外分光光度计（NanoDrop 2000，美国赛默飞世尔Thermo 公司）测量OD 值，用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，Qubit 定量的浓度≥15 ng/μL，由杭州联川生物技术股份有限公司进行10×深度的全基因组重测序。

1.2.2 肉色性状测定 90 日龄时，随机挑选200 只鸡进行屠宰。胸肌颜色以CIELAB 体系进行测定，使用M-600D 色度计（柯尼卡美能达办公系统（中国）有限公司）检测肌肉的L（亮度）、a（红度）、b（黄度），测定3 个不同区域的色差值，最后求平均值。测得数据经过Excel 2016 整理，进行GWAS 分析。

1.3 测序数据的质控 使用FastP（0.19.3）对原始数据（RawData）进行预处理。主要步骤为：去除接头（Adapter）；去除含有N（N 表示无法确定碱基信息）的比例大于5% 的reads；去除低质量reads；利用BWA 将CleanData 的数据比对到参考基因组上，并使用GATK 软件进行SNP 的检测，并对检测到的变异位点进行质量过滤。SNP 的质量过滤标准：QD>2.0、FS>60.0、MQ>40.0、MQRankSum>-12.5、ReadPosRankSum>-8.0、SOR>3.0。群体过滤标准：去除最小等位基因频率小于5%（MAF<0.05）的位点和缺失率大于5%的位点（geno>0.05）。

1.4 全基因组关联分析

1.4.1 关联分析模型 使用EMMAX（version beta-07）中的混合线性模型，对儋州鸡肉色性状与全基因组上SNP 进行GWAS 分析，混合线性模型如下：

=+++

其中，表示儋州鸡肉色性状表型值；表示性状的平均值；表示固定效应矩阵，为固定效应向量；表示剩余多基因效应；表示表型值的随机残差，和均服从正态分布。

1.4.2 群体结构分析 为消除连锁不平衡对个体间遗传相关估计的偏差，选用独立的SNPs，利用Plink（1.9）进行SNPs 筛选，以50 个位点为一个窗口，以5 个位点为步长，设为0.2。利用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）方法对群体结构进行分析，利用R 作图。

1.4.3 多重检验 利用Bonferroni 方法对SNPs 的显著性进行判定。SNP 的值若小于0.01/N 的值（N 表示质控后的SNP 数目），则SNP 与性状全基因组水平显著关联；若SNP 的值小于0.1/N 的值，则表示SNP 与性状潜在显著关联。

1.5 基因注释及候选基因筛选 利用Ensembl（oct2018.archive.ensembl.org/Gallus-gallus/Info/Index）和NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索显著及潜在关联SNP 位点前后各100 kb 区域的上下游基因，将所得到的基因与GO、KEGG 等数据库比对，根据基因注释情况分析可能的候选基因。

2 结果与分析

2.1 儋州鸡表型和基因分型数据质控 儋州鸡肉色性状统计结果见表2。质控前有200 个个体，20 897 371 个SNP 位点，按质控标准进行质控后，最终有200 个个体、12 424 543 个SNP 位点保留下来可用于后续的GWAS关联分析。SNP 分布如图1 所示，SNP 主要分布在转录本和内含子区。

图1 SNP（A）和InDel（B）位置分布

表2 儋州鸡肉色性状描述性统计

2.2 群体结构分析 由图2 可知，实验群体不存在分层现象，群体未出现家系分化，适宜进行后续的GWAS 分析。

图2 儋州鸡群体主成分分析

2.3 儋州鸡体尺性状全基因组关联分析结果 本研究采用EMMAX 软件对儋州鸡肉色性状进行GWAS 分析，校正方法为Bonferroni，确定肉色性状全基因组水平显著性阈值为8.049×10（0.01/12 424 543），潜在阈值为8.049×10（0.1/12 424 543）。由图3 可知，与肉色性状相关的全基因组和潜在显著水平的SNP 位点分别为6 个和13 个。其中，与肉色b关联的SNP 有10 个，分布在1、2、4 号染色体上；与肉色a关联的SNP 有4 个，分布在1、2、5 号染色体上；与肉色L关联的SNP 有5 个，分布在1、2 号和Z 染色体上。

图3 全基因组关联分析曼哈顿图和QQ 图

2.4 候选基因功能注释 由表3 可知，利用NCBI 网站，对SNPs 进行注释。在各显著和潜在显著关联的SNPs上下游区域内，共发现67 个基因，其中20 个是未表征基因。使用GO 数据库和KEGG 数据库对其进行生物信息学分析，发现基因可作为儋州鸡肉色性状候选基因（表4）。

表3 肉色性状的全基因组和潜在显著关联SNP 位点

表4 重要候选基因

3 讨论

肉色是衡量肉品质的重要指标之一，能够反映肌肉的生理生化特点及微生物学变化。肌肉中色素含量、分布及其化学状态均决定了肉色的深浅及分布的均匀度，同时肌肉色素对肉色深浅的影响还受到pH 的影响。肌肉色素包括肌红蛋白、血红蛋白和微量有色代谢物（维生素B、黄素蛋白、细胞色素等），其中肌红蛋白（Mb）的含量最高，是肌肉色素的基本组成成分，肌红蛋白有3 种存在形式：还原型肌红蛋白（紫红）、氧合肌红蛋白（鲜红）、高铁肌红蛋白（褐色），因此肌红蛋白的化学结构对肉色有较大的影响。另外，线粒体活性、肌肉结构完整性、脂质氧化、糖酵解和pH有关的肌肉代谢机制影响着肌红蛋白的化学结构。这些机制通过影响肌红蛋白的氧化、氧化和还原反应，从而影响肌肉维持颜色稳定的能力。在本研究中，基于10×重测序对儋州鸡肉色性状进行GWAS 分析，在全基因组及潜在显著水平中发现19 个SNP 与肉色性状相关。

肌肉中的肌红蛋白作为肌肉储存氧的结构物质，是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，肌红蛋白的构象及合成代谢与肌肉氧化还原密切相关。Joseph 等研究发现在宰后肌肉中添加苹果酸、丙酮酸、琥珀酸盐和乳酸盐等糖酵解或三羧酸循环中间代谢产物，能够刺激肌肉再生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NADH），进而增加高铁肌红蛋白还原程度，影响着肉色。

本实验GWAS 预测到位于儋州鸡1 号染色体上酰基辅酶A 合成酶短链家族成员3（Acyl-CoA Synthetase Short-Chain Family Member 3，）候选基因作为一种线粒体酶可催化丙酸等短链脂肪酸转化为CoA 复合物。能够激活丙酰辅酶A 合成酶将丙酸盐转化为丙酰辅酶A，丙酰辅酶A 羧化酶将丙酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A，甲基丙二酰辅酶A 再通过甲基丙二酸单酰辅酶A 变位酶异构化为琥珀酰辅酶A，琥珀酰辅酶A 进入三羧酸循环并释放能量。由此推测是与肉色相关的候选基因，但相关功能性仍需进一步验证。

研究发现，肌内脂肪含量也影响着肉色，主要是因为脂肪细胞是白色的，肌内脂肪含量越高，肌肉亮度越大，即L值越大；pH 值下降过程中，肉表面对光的反射增加，也会产生浅色的外观；同时肌内脂肪含量受到脂代谢调控。本实验GWAS 预测到位于儋州鸡Z 号染色体上乙酰辅酶A 酰基转移酶2（Acetyl-Coenzyme A Acyltransferase 2，）是脂肪酸-氧化途径关键酶，可通过催化脂肪酸-氧化参与脂肪酸降解及延伸，在脂肪酸代谢中起着重要作用。脂肪酸在-氧化时产生乙酰辅酶A，在作用下缩合生成乙酰乙酰辅酶A，经过一系列酶促反应进入三羧酸循环彻底氧化，并释放能量，维持细胞活性。李文娟利用基因组芯片技术对肉品质相关的脂肪性状功能基因进行筛选和分析，发现基因是影响脂类代谢的关键基因。De Boer 等采用基因组芯片对不同小鼠脂质代谢组织进行了表达谱分析，检测到了等基因存在差异表达。Doi 等研究发现，脂蛋白脂肪酶（）受体基因可以使mRNA 表达水平增加，引起大鼠脂肪代谢异常。以上研究表明，三羧酸循环和脂肪代谢对肌肉色素沉积和代谢等生物过程起的重要作用进而影响肌肉色泽的改变。综上推测基因可列为影响儋州鸡肉色性状的重要候选基因。

4 结论

综上所述，利用10× 重测序对儋州鸡肉色性状进行全基因组关联分析，发现与肉色性状相关的全基因组和潜在显著水平的SNP 位点分别为6 个和13 个。经过KEGG 通路分析和GO 注释分析后，推测和基因可能是与肉色相关的候选基因。这些结果将为儋州鸡的育种工作提供候选的分子标记，为地方品种鸡标记辅助选择提供参考依据。