冰核蛋白对冻结与消融速度影响研究

陆丹旭， 龚建英， 何延青， 郭嘉宇， 李润玲

（1.河北建筑工程学院市政与环境工程系，河北张家口 075000；2.河北省水质工程与水资源综合利用重点实验室，河北张家口 075000）

20世纪70年代，Schnell等［1］发现腐烂树叶中含有一种重要的冰核物质，开启了细菌成冰核作用的研究.随后，Maki等［2］从腐烂的赤杨树叶中提取分离得到了一种名为丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的细菌，发现将这种细菌添加到0 ℃时依然为液体状态的过冷却水中就能催化诱导它形成冰晶，并把这种特性称作细菌的冰核活性. Lindow等［3］发现草生欧文氏菌（Erwinea herbicola）也是一种冰核细菌. 在这之后，许多国家的学者对冰核细菌深入研究，发现了具有同种特性的3个属19个种或变种为冰核细菌［4］. 冰核细菌能够在细胞外膜产生一类特殊蛋白质——冰核活性蛋白（ice nucleation protein，INP）［5-8］，INP 是细菌表面展示系统中经典的载体蛋白，是存在于荧光假单胞菌、假单胞杆菌、黄单胞菌属和欧氏杆菌等细菌种属中的一种分泌性型表面蛋白［9］. INP拥有可在-5～-2 ℃这样相对高的温度下形成质地细腻、外形规则的微小异质冰晶的能力［10］. 具有冰核蛋白冰核活性的细菌在冰核蛋白的作用下能使水分子按照一定的顺序规则排列形成质地细腻的冰晶核. 目前对于冰核蛋白的研究与应用主要集中在促冻杀虫、植物保护、作物抗寒育种、食品工业以及人工降雪等领域［11-16］，但是目前冰核蛋白在人工造雪中应用效果的研究报道并不多.

随着全球气候变暖导致的气候极端性和不稳定性上升，导致北半球积雪面积呈下降趋势［17］，全球许多冬季旅游胜地都因为降雪量少或环境温度过高而出现了少冰缺雪的现象. 人为添加冰核蛋白作为晶核的人工造雪技术，可以在0 ℃左右成雪，且雪粒间不会相互粘连，物理抗击性能好，成雪密度和含水量更易满足滑雪场的造雪需要［18］. 而且可以提高水的利用率，有效节约水资源并保护水环境［19］. 因此，冰核蛋白在制造冰雪技术方面具有重大的推广价值［20］. 但是，目前商用生物冰核剂造价高，不利于国内需求量大的滑雪场大规模使用. 筛选优化出适于在我国冰雪产业中应用的新的冰核蛋白剂，对于我国在冰雪产业领域拥有节水型人工冰雪制剂和相关产品的自主研发权，争取逐步脱离进口做到自给自足，从而推动我国在冰雪产业的高质量发展具有重要的意义.

1 实验方法与实验过程

1.1 菌种来源与保存

本研究所用的冰核蛋白原液由中科院微生物研究所提供.

菌种优化过程：以Pantoea ananatis基因组DNA 为模板，以XhoI 和BglⅡ为引物，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增冰核蛋白（INP）基因，并插入到pYB1S的XhoI和BglⅡ位点，产生pYB1S-INP. 将该质粒转化到大肠杆菌BW25113 中，得到用于INP 表达的重组菌株BW/pYB1a-INP. 大肠杆菌BW/pYB1a-INP 菌株用LB 培养基，氨苄西林（50 μg）250 r/min，37 ℃培养. 将过夜培养物接种到含有1%接种物的自诱导培养基ZYM 培养基中，并在30 ℃振荡培养16 h. 通过在8000×g 下离心10 min 来收集诱导后的细胞，用去离子水洗涤四次，然后悬浮在去离子水中以形成细胞悬浮液（OD600=10 OD/mL）并通过超声裂解. 之后原液分装并-20 ℃冷冻保存，本实验中所使用的冰核蛋白原液的初始质量浓度为0.23 mg/mL.

1.2 不同浓度冰核蛋白溶液的制备

每次实验前先将原液样品冰上解冻后和水混合进行稀释，解冻后的冰核蛋白原液用自来水混合稀释分别稀释10 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、2000 倍和5000 倍，即分别得到质量浓度为2.3×10-2、2.3×10-3、4.6×10-4、2.3×10-4、1.15×10-4、4.6×10-5mg/mL 的冰核蛋白溶液. 在实验中，相同体积的自来水样本作为空白对照组.

预实验发现直接使用自来水水温较高，降温至各组实验温度所需时间较长，所以本实验全部采用提前准备好的4 ℃自来水制备溶液，这也更加接近冬季用水的实际情况.

1.3 实验过程

实验中使用的冰核蛋白混合溶液体积有100 mL和1000 mL两种.

冻结实验在焓差室中进行，具体步骤为：①调整焓差室温度，实验温度分别为-5 ℃、-10 ℃和-15 ℃，控制环境温度误差为±0.5 ℃. ②在室温下迅速稀释好的不同浓度的混合溶液后快速放置到焓差室中后，记录时间和环境温湿度，每隔5 min人工观察烧杯中溶液冻结的变化，全程利用摄像机做好过程记录. ③待所有烧杯中的溶液表面均冻结后，实验结束. 每次冻结实验的观察时间为120 min，如果120 min内未能够冻结，记录为“未冻结”.

消融实验在实验室常温条件下进行，观察消融的过程并随时记录观察到的现象和变化.

2 实验结果分析

2.1 -5 ℃不同浓度冰核蛋白溶液冻结速度的比较

-5 ℃的环境温度下在焓差室内进行了2次实验，第一次实验溶液的体积为100 mL，第二次实验溶液的体积为1000 mL. 具体结果参见表1.

表1 -5 ℃不同浓度冰核蛋白溶液的冻结时间Tab.1 Freezing times of ice nucleoprotein solutions with different concentrations at-5 ℃

第一次实验中发现添加冰核蛋白确实加快了溶液冻结的速度；而且从总的趋势来看，添加冰核蛋白溶液浓度越高，溶液冻结的速度越快. 但是添加冰核蛋白的质量浓度大于4.6×10-4mg/mL时，提高核微生物溶液浓度，溶液冻结的速度变化很小，而且添加的冰核蛋白溶液浓度过高会造成溶液的透明度低，从而导致最后成冰的透明度不够好；同时最终成冰会伴随较多的气泡，且不如浓度低的溶液产生的冰坚实. 所以，从增加浓度与提高冻结速度的成本、效益以及成冰质量综合考虑，后续实验只用质量浓度为4.6×10-4、2.3×10-4、1.15×10-4、4.6×10-5mg/mL的溶液进行实验.

第二次实验每组实验所使用各浓度溶液的体积由100 mL 增加为1000 mL，实验现象与结果与前两组实验基本一致，结冰是从溶液表面开始的，先有冰碴、逐渐形成冰层后才继续向下延展；与空白溶液的冻结速度相比较，添加冰核蛋白可以加快冻结速度（图1）. 由此可见，冰核蛋白用于大规模造雪、成冰是具有发展前景和应用优势的.

图1 不同浓度冰核蛋白溶液冻结实验Fig.1 Freezing experiments of ice nucleoprotein solutions with different concentrations

2.2 -10 ℃不同浓度冰核蛋白溶液冻结速度的比较

-10 ℃的环境温度下在焓差室内同样进行了两次实验，第一次实验所使用不同浓度溶液的体积为100 mL，第二次实验每组实验所使用不同浓度溶液的体积为1000 mL. 具体结果参见表2.

表2 -10 ℃不同浓度冰核蛋白溶液的冻结时间Tab.2 Freezing times of ice nucleoprotein solutions with different concentrations at-10 ℃

通过实验发现：添加冰核蛋白快了溶液冻结的速度；低浓度溶液结冰后透明度更高，高浓度溶液结冰后会有较多气泡. 在溶液冻结速度接近的情况下，4.6×10-4mg/mL 的溶液中生成的冰与其他质量浓度的溶液相比，虽然溶液冻结的速度较快，但是透明度与硬度相对会差一些. 相对于其他质量浓度溶液来讲，4.6×10-5mg/mL 的溶液和空白组生成的冰层硬度更高也更透明，但是4.6×10-5mg/mL的溶液比4.6×10-4mg/mL的溶液结冰速度慢. 兼顾冰的质量与结冰所需时间，1.15×10-4mg/mL的溶液冻结速度更为适宜，此浓度可能是效果最佳的. 但是-10 ℃环境温度实验的效果没有-5 ℃环境下的实验明显. 而在相同实验条件下，不同实验溶液体积实验对比发现，体积1000 mL 的溶液冻结实验中所用冻结时间小于100 mL溶液冻结实验，这是由于随着实验溶液体积增大，实验所用器皿变大，因此，实验溶液与环境接触面积增大，散热面积增加的缘故.

2.3 -15 ℃不同浓度冰核蛋白溶液冻结速度的比较

-15 ℃的环境温度下在焓差室内进行了一次实验，实验所使用的溶液体积均为1000 mL. 实验具体结果参见表3.

表3 -15 ℃不同浓度冰核蛋白溶液的冻结时间Tab.3 Freezing times of ice nucleoprotein solutions with different concentrations at-15 ℃

通过-5 ℃、-10 ℃和-15 ℃三个不同环境温度下溶液冻结速度与成冰效果的实验对比分析，可以看出，温度越低冰核蛋白对成冰速度的影响越小，而在-5 ℃时，添加冰核蛋白对成冰速度的提高影响较为显著. 因此，在-5 ℃这样相对高的温度下添加冰核蛋白确实有利于增加溶液冻结的速度.

2.4 消融实验

为了能够更直观地观察不同浓度冰核蛋白对冰消融的速度的影响，取体积为1000 mL，冻结温度-5、-10 ℃，冰核蛋白溶液质量浓度为4.6×10-4、2.3×10-4、1.15×10-4、4.6×10-5mg/mL 以及空白对照组样品放入冰箱内完全结冰，取出后在18 ℃的室温环境下进行消融实验，具体结果见表4.

表4 不同稀释浓度溶液的消融开始发生消融时间Tab.4 Onset time of ablation for solutions with different dilution concentrations

-5 ℃下冻结样品消融实验中：14 min 时空白样品杯壁处消融，样品中心已经有气泡，冰能够活动；19 min时4.6×10-5、1.15×10-4、2.3×10-4mg/mL 的样品烧杯底部有消融，其中，4.6×10-5mg/mL 的样品最明显；27 min时4.6×10-5mg/mL 的样品已经能在烧杯中活动；32 min时1.15×10-4mg/mL 的样品也能活动，2.3×10-4mg/mL 的样品变得更透明、杯壁处消融但不能活动.

-10 ℃下冻结样品消融实验中：19 min时空白样品的烧杯底部有消融；27 min时4.6×10-5mg/mL的样品开始消融滴水；32 min时2.3×10-4、1.15×10-4mg/mL的样品变得透明度变高、杯壁处开始消融；50 min时4.6×10-4mg/mL样品中不断有水滴滴下来，但是速度缓慢；62 min时所有样品都开始加速消融，其中空白样品的消融速度最快.

通过消融实验（图2）发现：添加冰核蛋白后能够有效减缓消融的速度，使冰保持的时间更长，且冰核蛋白溶液质量浓度最高的4.6×10-4mg/mL 样品消融速度最慢.

图2 不同浓度冰核蛋白溶液消融实验Fig.2 Ablation experiments of ice nucleoprotein solutions with different concentrations

3 结论

通过添加不同浓度冰核蛋白之后溶液冻结以及消融速度的实验对比得出如下结论：

1）本研究的冰核蛋白由于其成冰核活性能够影响冰的冻结过程和消融过程，相比不添加冰核蛋白的空白对照组，添加冰核蛋白的实验组能够加快溶液冻结的速度，也能延长溶液冻结的时间.

2）在一定添加浓度的范围内，添加的冰核蛋白浓度越低，成冰的透明度越高.

3）添加不同浓度冰核蛋白的效果在环境温度较高的情况下较为明显，当环境温度过低时，添加冰核蛋白作用对溶液冻结速度的影响不明显.

综上，利用本种冰核蛋白作为晶核能够影响溶液成冰的速度和质量，也能够有效减缓冰消融的速度并提高冰保存的时长. 从冰的冻结速度、透明度和坚实程度综合考虑，添加质量浓度为1.15×10-4mg/mL（即稀释2000倍）的冰核蛋白作为冰晶核可以有效提升水—冰相变的效率，如应用于人工造雪技术，在冬季早晚典型的边际天气条件下可以更加有效提高人工造雪的效率.