FLT3突变急性髓系白血病的临床特点及其伴随突变对预后的影响*

冯砚平，王 楠，王伟佳△

1.新乡医学院医学检验学院，河南新乡 453003；2.广东省中山市人民医院检验医学中心，广东中山 528400

急性髓系白血病(AML)是一种基因异质性疾病，不同的遗传特性和分子机制改变致使患者在临床特征、发病机制、治疗效果及预后方面存在差异[1]。FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)突变是AML中最常见的基因异常之一，可在25%～30%的新发AML患者中检出[2]。以往研究表明，FLT3突变与AML患者的不良预后有关，对患者选择治疗方案及评估预后具有指导价值[3]。但是，FLT3突变阳性的AML患者预后并不完全一致，因为这些患者往往同时存在其他基因异常，伴随的异常基因也在疾病特征中扮演重要角色。因此，有必要更加深入地研究FLT3突变阳性AML患者的临床特征，以及其共存基因突变对疾病治疗效果及预后的影响，为临床精准地治疗提供依据。本研究通过收集中山市人民医院收治的初诊FLT3突变阳性AML患者的临床资料，综合分析FLT3突变阳性患者的临床特点、伴随突变基因分布及伴随突变对治疗效果和预后的影响，为细化AML患者风险分层及个性化治疗方案的制订提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年8月1日至2020年3月31日中山市人民医院血液内科收治的初诊AML患者，所有患者均通过细胞形态学、免疫学分型、细胞遗传学和分子生物学(以上4项简称MICM)相关标准明确诊断，由广州金域医学检验中心进行染色体核型、融合基因和AML相关基因突变检测。病例纳入标准：(1)经MICM确诊为AML的初诊患者；(2)至少经过2个疗程的化疗，并在每次化疗结束后2周或下一次化疗前抽取骨髓评估治疗效果；(3)获得完全缓解(CR)后继续进行巩固治疗或选择造血干细胞移植。排除标准：(1)AML M3型患者；(2)入院前曾在其他医院诊断并接受治疗的患者；(3)化疗达到CR后未继续巩固治疗的患者；(4)资料不完善者；(5)失访患者。本研究共纳入AML患者109例，其中男56例、女53例，FLT3突变阳性患者34例、FLT3突变阴性患者75例。本研究通过医院医学伦理委员会批准，所有患者家属签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1治疗和随访 白细胞计数(WBC)过高的AML患者治疗前，首先使用白细胞单采清除术或服用羟基脲的方法预处理，去除过多的白细胞。依据患者的年龄、身体状况及骨髓增生程度，与患者及其家属沟通，选择最合适的化疗方案。方案包括：DA(柔红霉素+阿糖胞苷)、MA(米托蒽醌+阿糖胞苷)、IA(去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷)、CAGD(粒细胞集落刺激因子+阿糖胞苷+阿克拉霉素+地西他滨)、HAA(高三尖杉酯碱+阿克拉霉素+阿糖胞苷)等。CR患者使用中/大剂量阿糖胞苷或联合氟达拉滨、蒽环类药物等方案继续巩固治疗或进行造血干细胞移植。入组病例的随访日期截至2020年8月31日，中位随访时间7个月。总生存时间指从患者确诊到死亡或随访结束的时间，无病生存时间(DFS)指从患者治疗后第1次达到CR至患者复发、死亡或随访结束的时间。

1.2.2基因突变检测、融合基因检测和染色体核型分析 用EDTA-K2抗凝管留取入组病例的骨髓标本，按照说明书操作，使用Ficoll分离液分离骨髓标本中的单个核细胞，使用细胞基因组DNA提取试剂盒提取DNA，应用一代测序的方法检测AML常见的30种基因突变；按照Trizol试剂盒的操作说明，提取总RNA，按照反转录试剂盒的操作要求，反转录合成cDNA，然后通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术要求，检测25项融合基因。按24 h培养法常规检测染色体，收集有丝分裂中期细胞，常规制片，按照R显带技术分析10～20个分裂中期细胞，参考《人类细胞遗传学国际命名体制》(ISCN2013或2016版)进行异常核型的描述。

1.3统计学处理 使用SPSS20.0统计软件进行数据处理和分析。不符合正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示，组间比较采用秩和检验；计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；使用Kaplan-Meier法进行生存分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1FLT3突变阳性患者的临床特点 本研究中FLT3突变阳性患者34例，FLT3突变阴性患者75例。(1)在临床特征方面：与FLT3突变阴性患者比较，FLT3突变阳性患者在性别，初诊血红蛋白(Hb)水平、血清乳酸脱氢酶(LDH)水平、骨髓原始细胞比例，FAB分型方面差异无统计学意义(P>0.05)；FLT3突变阳性患者的中位年龄明显大于FLT3突变阴性患者(P<0.05)；与FLT3突变阴性患者相比，FLT3突变阳性患者初诊WBC、血小板计数(PLT)明显升高(P<0.05)。(2)在细胞遗传学及分子生物学方面：FLT3突变阳性患者中有32.4%伴有染色体核型异常，与FLT3突变阴性患者比较，差异无统计学意义(P>0.05)；FLT3突变阳性患者融合基因阳性率低于FLT3突变阴性患者(P<0.05)；通过基因突变检测发现，44.1%的FLT3突变阳性患者同时伴有NPM1突变，明显多于FLT3突变阴性患者(P<0.05)；41.2%的FLT3突变阳性患者同时伴有DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)突变，明显多于FLT3突变阴性患者(P<0.05)。(3)在治疗效果与预后方面：化疗后，FLT3突变阳性患者1个疗程、两个疗程CR率低于FLT3突变阴性患者(P<0.05)；化疗结束后进行随访，FLT3突变阳性患者1年总生存(OS)率略低于FLT3突变阴性患者，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。

表1 FLT3突变阳性与FLT3突变阴性AML患者临床特征比较

图1 FLT3突变阳性与FLT3突变阴性AML患者的生存曲线

2.2FLT3突变阳性患者伴随基因突变的分布情况 对34例FLT3突变的AML患者，进行30项AML相关基因突变检测，发现88.2%(30/34)的患者同时伴有其他类型的基因突变。其中阳性率最高的是NPM1突变，占44.1%(15/34)，其次是DNMT3A突变，占41.2%(14/34)。

2.3NPM1突变对FLT3突变阳性AML患者治疗效果及预后的影响 以是否合并NPM1突变，将FLT3突变阳性患者分为FLT3+/NPM1+组和FLT3+/NPM1-组。将75例FLT3突变阴性患者作为FLT3突变阴性组。从治疗效果和预后方面分析，经过1个疗程化疗后，FLT3+/NPM1+组患者CR率为73.3%，与FLT3突变阴性组的66.7%比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但明显高于FLT3+/NPM1-组患者的21.1%，差异有统计学意义(P<0.05)；FLT3+/NPM1+组的两个疗程CR率也同样明显高于FLT3+/NPM1-组(P<0.05)。化疗结束后进行随访：FLT3+/NPM1+组患者1年OS率为100.0%；FLT3+/NPM1-组患者1年OS率为50.0%；FLT3突变阴性组患者1年OS率为83.6%。与FLT3+/NPM1-组患者相比，FLT3+/NPM1+组患者的预后相对更好。见表2、图2。

表2 FLT3+/NPM1+组、FLT3+/NPM1-组与FLT3突变阴性组患者预后情况比较[%(n/n)]

图2 FLT3+/NPM1+、FLT3+/NPM1-与FLT3突变阴性患者的生存曲线

2.4DNMT3A突变对FLT3突变阳性AML患者治疗效果及预后的影响 以是否合并DNMT3A突变，将FLT3突变阳性AML患者分为FLT3+/DNMT3A+组和FLT3+/DNMT3A-组。将75例FLT3突变阴性患者作为FLT3突变阴性组。从治疗效果和预后方面分析，FLT3+/DNMT3A+组患者经过1个疗程化疗后，CR率为50.0%,与FLT3+/DNMT3A-组及FLT3突变阴性组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，3组患者的两个疗程CR率亦差异无统计学意义(P>0.05)。两个疗程化疗结束后进行随访：FLT3+/DNMT3A+组1年OS率为42.9%；FLT3+/DNMT3A-组患者1年OS率为77.8%；FLT3突变阴性患者1年OS率为83.6%。与FLT3突变阴性组和FLT3+/DNMT3A-组患者相比，FLT3+/DNMT3A+组患者的1年OS率明显下降(P<0.05)。FLT3+/DNMT3A+组患者的总生存期明显缩短(P<0.05)。见表3、图3。

表3 FLT3+/DNMT3A+、FLT3+/DNMT3A-与FLT3突变阴性患者预后情况比较[%(n/n)]

图3 FLT3+/DNMT3A+、FLT3+/DNMT3A-与FLT3突变阴性患者的生存曲线

3 讨 论

AML是一种以造血干细胞和祖细胞的分化阻断和克隆增殖为特征，以牺牲正常造血功能为代价的血液系统恶性肿瘤，在临床上具有恶性程度高、异质性大的特点[1]。尽管大部分AML患者在经过化疗后可以达到CR，但却有相当一部分患者无法达到CR而成为难治性AML，并且仍有大量患者在缓解后由于复发而出现病情反复甚至进展，最终导致死亡。随着对AML研究的不断深入以及多种实验技术的发展，人们发现AML患者不仅在细胞谱系方面存在差异，在细胞遗传学和分子生物学的表现也各不相同，这些差异直接影响患者的临床特征、治疗效果及预后。位于染色体13q12上的FLT3突变是AML中最常见的基因异常之一，具有促进细胞增殖和减少细胞凋亡的作用，25%～30%新诊断的AML患者被检测出FLT3突变[2]。

本研究对109例初诊AML患者的临床资料进行了分析，结果表明，有34例患者存在FLT3突变，占31.2%，与DAVER等[2]报道结果一致。FLT3突变后增加酪氨酸激酶活性，进而导致下游信号通路(如RAS/MAPK、STAT5等)的结构性激活，诱导细胞异常增殖和凋亡受阻[4]。FLT3突变阳性的AML患者经常伴有WBC增多及骨髓原始细胞比例高的特点[5]，但也有研究认为，FLT3突变不影响PLT和Hb[6]。在本研究中，FLT3突变阳性AML患者的初诊WBC和PLT均明显高于FLT3突变阴性患者(P<0.05)，而两组患者初诊Hb和骨髓原始细胞比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。有研究指出，FLT3突变多见于FAB分型中的M3型和M5型，在M2型及M6型中突变阳性率较低[7]，而本研究入组的FLT3突变阳性患者中，以M2和M4型多见，共占70.6%。以往一些研究指出，伴有FLT3突变的AML患者易同时伴有其他与白血病相关的基因异常，其中以NPM1突变多见[8]。在本研究中，有88.2%(30/34)的FLT3突变阳性患者同时伴有其他类型的基因突变，其中检测到阳性率最高的是NPM1突变，占44.1%(15/34)，其次是DNMT3A突变，占41.2%(14/34)，与FLT3突变阴性患者相比，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，本研究通过对入组患者进行髓系白血病常见融合基因筛查检测，发现FLT3突变阳性患者中只有11.8%(4/34)被检测出融合基因阳性，阳性率明显低于FLT3突变阴性患者(38.7%，29/75，P<0.05)，提示FLT3突变更常见于融合基因阴性的患者。

FLT3突变阳性AML患者具有总生存期短、复发率高、预后差的特点，尤其是在等位基因比例较高的患者中[9]。本研究的患者经过两个疗程的标准方案化疗后结果显示，伴有FLT3突变阳性患者的1个疗程CR率及两个疗程CR率均低于FLT3突变阴性的患者(P<0.05)。

NPM1基因编码在细胞核与细胞质之间穿梭的多功能伴侣蛋白，作用于细胞物质运输、细胞分裂、增殖等方面，突变的NPM1蛋白可使PU.1在细胞质中移位，从而进一步阻止PU.1与CEBPα/RUNX1的相互作用，并阻断单核细胞和粒细胞的分化[10]。NPM1突变在AML中十分常见，发生率为21%～35%[11]。既往研究报道，单纯NPM1突变的正常核型AML患者被划入低风险组，是提示预后良好的因素[12]。FLT3突变常伴有NPM1突变，并可能对患者预后产生一定影响。本研究发现，FLT3+/NPM1+组患者的1个疗程CR率与两个疗程CR率与FLT3阴性组患者差异无统计学意义(P>0.05)，但明显高于FLT3+/NPM1-组(P<0.05)，并且FLT3+/NPM1+组患者的1年OS率也明显高于FLT3+/NPM1-组患者(P<0.05)，提示当NPM1突变存在时，FLT3突变阳性患者的预后改善。

DNA甲基化、RNA介导的基因沉默和组蛋白修饰等在内的表观遗传修饰因子失调与AML发病有关[13]。DNMT3A是一种与表观遗传修饰相关的重要蛋白酶[14]，负责CpG二核苷酸的从头甲基化。研究结果表明，DNMT3A突变破坏了甲基转移酶蛋白亚基的正常连接，对DNMT3A蛋白功能产生显著的负面影响[15]。DNMT3A突变作为易与FLT3突变同时出现的常见分子学变异，被许多研究认为与较差的预后有关[16]。在本研究中，FLT3+/DNMT3A+组患者化疗后1个、两个疗程的CR率与FLT3+/DNMT3A-组及FLT3突变阴性组均差异无统计学意义(P>0.05)，而FLT3+/DNMT3A+组患者的1年OS率及总生存期明显低于FLT3+/DNMT3A-组和FLT3突变阴性患者(P<0.05)，提示当FLT3突变阳性患者同时伴有DNMT3A突变时，预后明显变差。

综上所述，伴有FLT3突变阳性的AML患者常表现为年龄偏大、WBC与PLT升高、CR率低的特点，并常同时存在其他类型的基因突变，其中以NPM1和DNMT3A突变最为多见。不同的伴随突变会对患者预后产生一定的影响，应根据不同的伴随突变对FLT3突变阳性AML患者进行更加精细的风险分层。