血清miR-520d-3p和miR-627检测在创伤性脑损伤诊断及预后监测中的临床价值*

闫 静，李 全，李丹丹，季明德△

1.南京中医药大学附属医院检验科，江苏南京 210029；2.南京大学附属金陵医院检验科，江苏南京 210002

创伤性脑损伤(TBI)的发病率正逐年上升，在年轻人及儿童中尤为突出。重度创伤性脑损伤(sTBI)的高致死率、高致残性严重影响人类的生命健康和生活质量。尽管绝大多数轻度创伤性脑损伤(mTBI)患者伤后无须治疗，但部分患者会持续进展为脑震荡综合征，并在认知、行为、精神等方面表现出不同程度的功能障碍[1]。目前临床上主要依靠患者的临床症状、体征、影像学检查，如电子计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)和实验室检查[神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、钙结合蛋白B(S100B)、微管相关蛋白Tau、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)]等对TBI进行诊断，然而这些检测方法在sTBI的疗效评估与预后评估方面存在不同程度的局限性，并且针对影像学表现正常的mTBI患者，大部分实验室检查指标的敏感性极低，给mTBI的判定带来一定的困扰[2]。因此，目前迫切需要寻找一种简便、特异的新型生物标志物判断TBI患者的病情、疗效及预后情况，这对mTBI患者能够及时进行诊断、治疗具有重要的临床意义。

微小核糖核酸(miRNA)是一类内源性高度保守的非编码单链小RNA，在转录后调控基因表达，参与调控多种生物学过程[3]。目前，多项研究显示TBI患者血清miRNA表达水平发生明显变化，miRNA具有潜在的生物学诊断价值[3-6]。因此，本研究旨在对不同严重程度TBI患者及其治疗前后血清miR-520d-3p和miR-627的表达水平进行分析，探讨其与预后的关系，以期为TBI的诊断、疗效评估、预后监测提供新的方法。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2014年7月至2017年7月在南京大学附属金陵医院确诊的134例TBI患者及67例健康对照者(健康对照组)纳入研究。健康对照组中男54例、女13例，年龄(49.30±11.82)岁。采用格拉斯哥昏迷指数评分(GCS)系统，将GCS>12分的TBI患者纳入mTBI组(67例)，其中男48例、女19例，年龄(45.67±15.13)岁；GCS≤8分的TBI患者纳入sTBI组(67例)，其中男54例、女13例，年龄(49.22±11.80)岁。TBI患者纳入标准:(1)头颅创伤24 h以内;(2)近期无其他手术史及药物治疗史。另外，所有TBI患者于伤后6个月利用格拉斯哥预后等级评分(GOS)进行预后评价，将GOS≤3分的患者作为预后差组，GOS>3分的患者作为预后好组。本研究的所有研究对象均知情同意，且得到伦理委员会批准(文件号：2015NZGKJ-019)。3组研究对象的年龄、性别、舒张压、收缩压比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 3组研究对象的一般资料比较

1.2仪器与试剂 采用上海医疗器械公司的高速离心机分离血清；检测仪器为美国Applied Biosystems(ABI)公司的7300型PCR仪；提取RNA的试剂采用索莱宝公司的酸性水饱和酚和上海国药集团试剂公司的分析纯级氯仿、异丙醇、无水乙醇；RNA保存于DEPC处理水(美国Sigma公司)中；反转录及实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)体系所用试剂购自大连TaKaRa公司；miR-520d-3p和miR-627探针及人工合成的peu-miR-2911购自美国ABI公司。

1.3方法

1.3.1标本采集与处理 采用真空采血促凝管收集健康对照者的清晨空腹血(禁食12 h以上)和TBI患者(入院时首次采集，以及经2～8周治疗后采集，病情好转者出院当日再次采集)的空腹静脉血标本3.5 mL。所有受试者的血标本均离心后取上层血清，并置于-80 ℃保存备用。

1.3.2血清miR-520d-3p和miR-627表达水平测定 采用Trizol提取法提取血清中的总RNA。通过反转录反应体系及TaqMan探针将miR-520d-3p和miR-627分别反转录为cDNA，反应条件为16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用ABI 7300 qRT-PCR系统进行扩增反应，反应条件为95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。以miR-2911作为外参，在标本提取过程中加入20 μL 106 fmol/L miR-2911(5′-GGCCGGGGGACGGGCUGGGA-3′)，监测标本提取过程，并将待测miRNA与miR-2911同时检测。扩增结束后根据扩增曲线设定统一阈值，用仪器自带的分析软件分析扩增曲线，获得待测miRNA与miR-2911的Ct值，miR-520d-3p和miR-627的表达水平采用相对定量法(2-ΔCt，ΔCt=CtmiRNA-CtmiR-2911)进行计算。为了降低误差，每次实验设3个复孔，结果取平均值。

2 结 果

2.13组血清miR-520d-3p和miR-627表达水平比较 qRT-PCR检测结果显示，与健康对照组相比，mTBI组和sTBI组患者血清miR-520d-3p和miR-627表达水平均明显升高，且sTBI组患者血清miR-520d-3p和miR-627表达水平明显高于mTBI组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组血清miR-520d-3p和miR-627的表达水平比较[M(P25,P75)]

2.2TBI患者治疗前后血清miR-520d-3p和miR-627表达水平比较 分析所纳入研究的TBI患者入院时及经2～8周治疗后的血清miR-520d-3p和miR-627的水平变化，qRT-PCR检测结果显示，与治疗前相比，治疗后患者的miR-520d-3p和miR-627表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 TBI患者治疗前后血清miR-520d-3p和miR-627表达水平比较[M(P25,P75)]

2.3不同预后的TBI患者血清miR-520d-3p和miR-627表达水平比较 预后差组37例，预后好组97例。结果显示，与预后好组相比，预后差组的miR-520d-3p和miR-627表达水平明显较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同预后的TBI患者血清miR-520d-3p和miR-627表达水平比较[M(P25,P75)]

2.4TBI患者血清miR-520d-3p和miR-627表达水平的诊断价值 绘制ROC曲线，分析血清miR-520d-3p和miR-627对TBI的诊断效能。结果显示，血清miR-520d-3p诊断mTBI的AUC为0.866(95%CI:0.800～0.933，P<0.05)，诊断sTBI的AUC为0.913(95%CI:0.813～0.965，P<0.05)，鉴别诊断mTBI与sTBI的AUC为0.622(95%CI:0.527～0.718，P<0.05)，见图1A。血清miR-627诊断mTBI的AUC为0.832(95%CI:0.763～0.903，P<0.05)，诊断sTBI的AUC为0.890(95%CI:0.839～0.946，P<0.05)，鉴别诊断mTBI与sTBI的AUC为0.651(95%CI:0.558～0.743，P<0.05)，见图1B。

注：A为miR-520d-3p；B为miR-627；1为区分mTBI患者与健康对照者；2为区分sTBI患者与健康对照者;3为区分mTBI与sTBI患者；4为参考线。

3 讨 论

临床上判定TBI的首选检查方法是CT，但其敏感性较低，尤其是大部分mTBI患者的影像学表现无异常变化，临床医生仅能根据经验和GCS进行判断，难以准确判定mTBI。尽管MRI可以提高对微小病灶的检出率，但费用昂贵，患者难以负担，限制了其的推广和应用。目前已知的实验室大分子蛋白标志物对于TBI的诊断缺乏特异性[4]。因此，寻找一种新型、特异的生物标志物显得尤为重要。

miRNA具有高度保守性、时序性和组织器官特异性，且可调节人体各个系统的生理功能及参与疾病的发生、发展[5]。目前已发现多种miRNA高表达于中枢神经系统，并参与调节神经细胞发育、分化等重要生理过程[6-7]。多项研究结果提示miRNA与TBI的严重程度密切相关，是诊断TBI潜在的生物标志物[2-3]。

本研究前期采用低密度芯片技术筛选出miR-520d-3p和miR-627，结合qRT-PCR技术分析、验证两种miRNA在不同严重程度的TBI患者血清中的特异性表达情况，并观察了TBI患者治疗好转后的miR-520d-3p和miR-627表达水平变化情况。同时，结合患者出院后6个月的GOS进行综合分析，判断其预后情况。结果发现，miR-520d-3p和miR-627在不同严重程度的TBI患者血清中都呈高表达，且sTBI组的表达水平明显高于mTBI组，提示miR-520d-3p和miR-627可能与疾病的严重程度密切相关。因此，有理由推测表达水平升高的miR-520d-3p和miR-627可能通过调控某种蛋白进而使颅脑损伤后的病情恶化。本研究结果提示，miR-520d-3p和miR-627可以作为TBI患者潜在的诊断标志物，尤其为影像学表现正常的mTBI的诊断提供了较大的帮助，降低漏诊率。当患者病情好转，炎症指标基本恢复正常，脑水肿等症状明显减轻后，miR-520d-3p和miR-627的表达水平也明显下降，提示miR-520d-3p和miR-627可为疗效观察提供有效的基因学依据。另外，预后差组的miR-520d-3p与miR-627的表达水平明显高于预后好组，提示miR-520d-3p和miR-627的表达水平与预后密切相关，可以作为TBI患者预后判断的敏感指标。鉴于此，笔者推测血清miR-520d-3p和miR-627可能参与TBI病理过程的发生、发展，当脑组织受损时，神经细胞主动或被动释放miR-520d-3p和miR-627，并通过血脑屏障释放到血液中，本课题组也会在后续开展相关机制的研究。

ROC曲线分析显示，血清miR-520d-3p和miR-627不仅可以较好地区分健康人和sTBI患者，对健康人和mTBI患者也有较好的区分作用。同时对mTBI和sTBI也具有一定的鉴别诊断能力。由此可见，miR-520d-3p和miR-627不仅反映颅脑损伤的严重程度，对评估疗效和预后有重要意义，而且还可作为TBI潜在的诊断标志物。

TBI的发病机制非常复杂，目前相关报道常涉及神经细胞凋亡、炎性反应、可塑性改变等[8]。研究发现，miR-520d-3p和miR-627在神经系统性疾病中发挥着重要的生理、病理作用。DESHPANDE等[9]证实，miR-520d-3p通过靶向抑制信号调节蛋白α的表达，进而促进星形胶质细胞恶性程度的升高，提示miR-520d-3p可作为星形细胞瘤的诊断标志物。FAN等[10]发现，miR-627通过靶向NR2C2蛋白调控神经胶质细胞瘤的恶化。然而，目前较缺乏miR-520d-3p和miR-627在TBI发病机制中的研究。本课题组后续将在动物与细胞水平上开展机制研究，以期为TBI的诊断、治疗提供理论依据。