华支睾吸虫病诊断技术研究进展

曾雪梅　张梦玲　梁富雄

【关键词】华支睾吸虫病;分子生物学诊断技术;联合诊断

中图分类号：R532.23文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.05.013

华支睾吸虫病（Clonorchiasis），又称肝吸虫病，是一种由华支睾吸虫寄生于人体胆管内引发胆管病变的人畜共患寄生虫病，主要是食用了含有华支睾吸虫活囊蚴的淡水鱼虾所致[1]。轻度感染者常无症状或轻度腹痛，个别可因大量成虫堵塞胆总管而出现梗阻性黄疸、胆绞痛，更有慢性严重感染者会出现胆管炎、胆囊炎，甚至引发胆管癌[2]。在第三次全国人体重点寄生虫病现状调查中，华支睾吸虫病流行区主要分布在华南和东北两大片区，全国华支睾吸虫加权感染率为0.47%，推算感染人数约为598万人，其标化感染率为0.25%，较第一次寄生虫病现状调查（0.33%）和第二次寄生虫病现状调查（0.58%）分别下降了24.24%和 56.89%[3]。由此可见我国在寄生虫病防控方面取得了较为显著的成果。现阶段我国针对华支睾吸虫病诊断标准有详细规定，可根据流行病史、临床表现、实验室检查等来确诊病例[4]。笔者对华支睾吸虫病的病原学、影像学、免疫学、分子生物学诊断技术等的最新进展进行介绍，并阐述联合诊断及其优势，为提高华支睾吸虫病的诊断准确度提供参考依据。

1 病原学诊断

对人体粪便进行病原学虫卵检测是目前诊断华支睾吸虫病较为常用的方法，其中包括直接涂片法、饱和盐水漂浮法、水洗沉淀法、改良加藤厚涂片法（Kato-Katz法）和醛醚离心沉淀法[5]等。粪便查虫卵的检测方法准确率和检出率都较高，但需要从较少的粪便中找出虫卵，并且还需要对其形态进行准确辨认，对于轻度感染或早期感染者，其粪排虫卵量少并且排虫卵时间不规律等因素，使得病原学查虫卵难以提高诊断灵敏度。单次对粪便检测虫卵准确度并不高，甚至需要进行多次粪便涂片镜检才能确诊[6]。并且查虫卵对检测人员水平有着严格的要求，需要具有丰富的镜检经验，而且耗时耗力，因此病原学检测难以对华支睾吸虫病进行较大规模的现场检测。

2 影像学诊断

影像学技术可以对华支睾吸虫病住院患者出现肝胆病变之后进行诊断，并且对病变程度与病变部位的判断提供诊断依据。仅根据其临床表现易误诊为病毒性肝炎、胆囊炎等消化道疾病，因此需要对感染华支睾吸虫造成的肝胆病变利用影像学特征进行初步诊断，以便后续治疗。常规B超检查对华支睾吸虫病患者肝胆部位的异常改变进行一定的反馈，并且其具有简便、无创、价格低廉等优点，是华支睾吸虫病影像学诊断的首选方法[7]。急性、慢性华支睾吸虫病在肝胆部位会出现不同的症状，急性期可见胆管周围炎或肝脓肿，合并胆管炎症、胆管扩张多见;慢性期以胆道的慢性炎症、纤维化为主要表现，CT或MRI可见特征性肝内胆管弥漫性扩张[8～9]。肝吸虫病继发肝实质炎症少数病例与胆管细胞癌影像难鉴别，而MRI增强影像表现具有一定特征性，这对肝吸虫病的诊断有所助益。并且MRI检测胰胆管成像征象可准确反映胆道扩张的特征，彩色多普勒超声技术可检测到华支睾吸虫病患者的门静脉和血流变化，超声多普勒联合 MRI 可提高早期肝吸虫性胆道梗阻的确诊率[10～12]。影像学的检查还需要结合华支睾吸虫感染者的生食淡水鱼虾史，由于病症会跟随患者的患病时长发生变化，影像成像也会随之改变，因此单一使用影像学检查方法进行诊断存在一定的局限性。

3 血清免疫学诊断

病原学粪检虫卵通常要等到感染华支睾吸虫囊蚴4周后成虫发育成熟开始产卵才能检测，感染未能及时发现易导致严重后果，而酶联免疫吸附剂测定（ELISA）是符合现场检测和早期诊断华支睾吸虫感染强有力的检测方法。目前已有许多改进版的ELISA检测方法，如凝胶扩散-酶联免疫吸附剂测定（DIG-ELISA）、斑点ELISA（dot-ELISA）、生物素-亲和素酶联免疫吸附剂测定（ABC-ELISA）、单克隆抗体ELISA（McAb-ELISA）半胱氨酸蛋白酶ELISA等。其中寻找华支睾吸虫高敏感度、高特异性和高稳定性的抗原是ELISA诊断有效的关键。近年研究筛选出了一些对华支睾吸虫具有诊断意义的抗原抗体，CsAg17抗原检测灵敏度和特异度都较高，可以被应用于较大规模对华支睾吸虫的筛查和监测[13];以TPX、CatB4重组蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法[14];血清华支睾吸虫抗体联合EO%、ALT和GGT检测可提高无症状胆囊结石患者华支睾吸虫感染的诊断效率[15];重组抗原rCsSQ1和rCsSQ2定位于华支睾吸虫的口吸盘和腹吸盘，可以利用免疫荧光技术定位[16]等。利用血清免疫学技术可以凭借其灵敏度高、特异性强、方便快捷的优势对华支睾吸虫进行早期诊断，补充了粪检虫卵无法在华支睾吸虫感染早期检测的不足，可以广泛应用于现场的检测，但是其在高灵敏度、高特异性抗原的选取上仍有很大的发展空间。

4 分子生物学诊断

4.1 常规PCR近年来分子诊断技术不断发展，常规PCR成了在华支睾吸虫病诊断中被广泛应用的技术。单从形态学上对华支睾吸虫囊蚴的鉴别存在局限，运用PCR诊断技术一般会选取具有较高特异性的华支睾吸虫核糖体第二内转录间隔区（ITS2）基因进行检测[17]。利用PCR法检测粪便华支睾吸虫虫卵的基因具有较高的特异性，其检出阳性率高于Kato-Katz法检测结果，由于PCR技术是运用较为精密的仪器对数据进行处理分析，因此结果较为可靠[18～19]。王真瑜等人[20]根据华支睾吸虫囊蚴ITS2基因序列合成1对特异性CS1/CS2引物，对模板DNA进行PCR扩增，其结果具有高敏感度和强特异性等优点。但是PCR检测需要使用到PCR仪，携带不便，并且操作过程容易产生交叉污染，因此在大规模的检测华支睾吸虫感染现场调查中很少会用到该方法。

4.2 实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR or qPCR）定量扩增DNA的能力很大程度上提高了靶序列定量的精度，对检测病原体进行定性，还能够灵敏准确地进行定量，可以实时监测每次循环后 PCR 产物的变化，并生成荧光扩增曲线[21]。由于荧光检测的高灵敏度，实时荧光定量PCR能够较为准确地测量靶DNA的初始浓度，而且更为简易方便[22]。根据华支睾吸虫18S rRNA基因合成特异性引物和探针，建立了实时荧光定量PCR反应体系，以此对患华支睾吸虫病的重点人群进行检测[23]。实时荧光定量PCR需要优化引物和探针浓度，但其检测具有可重复性，在应用于华支睾吸虫病诊断方面仍有很大的發展空间。

4.3 巢式PCR巢式PCR （nested PCR）也稱套氏PCR，是利用两套PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩展反应，这使其降低了扩增多个靶位点的可能性，从而增加了检测灵敏度，又因为有两对PCR引物与检测模板配对，从而又增加了检测的可靠性。钉螺是华支睾吸虫的第一中间宿主，在25 μL的聚合酶链式反应体系中，即使在高浓度钉螺DNA的作用下，利用巢式PCR检测方法也能检测到高达0.16 fg的华支睾吸虫基因组DNA[24]。巢式PCR的检测方法减少了PCR后扩增产物的污染问题，但却增加了每次实验的复杂性。

4.4 环介导等温扩增技术环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种在人类寄生虫病检测中被广泛应用的检测技术。施维等人[25]以华支睾吸虫核糖体rRNA ITS-2的基因为靶序列设计LAMP引物，测出最优反映体系，其中60 ℃、 60 min为最优反应温度和时间，以成虫DNA为模板时扩增的最低限度可达10 fg。RAHMAN等人[26]对LAMP检测人类粪便样本的华支睾吸虫的灵敏度与特异性进行了细致的研究，对比Kato-Katz方法和实时荧光定量PCR的测定结果，LAMP结果显示其灵敏度和特异性分别可达97.1%（95%CI，90.1～99.2）和100%（95%CI，92.9～100）。朱海等人[27]建立了一种基于 ITS2 基因序列的淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴 LAMP 检测方法，其更适用于低浓度的 DNA 检测。LAMP还可根据扩增特异性DNA序列进行吸虫的鉴别诊断[28]。由于LAMP不需要PCR所必须的热循环仪器，这使其适用于华支睾吸虫的现场检测，综合其特异度和灵敏度，LAMP技术在华支睾吸虫病检测诊断方面具有极大的推广价值。

4.5 重组酶介导的等温核酸扩增技术重组酶介导的等温核酸扩增（recombinase aided amplification，RAA）是一种恒温体外核酸快速扩增技术。有研究以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列，设计、合成、筛选特异性引物和探针，以快速检测华支睾吸虫的检验技术。其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫 DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板，该方法最低检出限为10 拷贝/μL;以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板，该方法最低检出限为3 pg/μL[29]。RAA可应用于华支睾吸虫阳性粪便及鱼肉样本检测。在检测华支睾吸虫灵敏度方面，RAA检测法高于PCR法，略低于LAMP法。在特异性评价方面，RAA以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA 为模板时的扩增结果均为阴性，提示该方法具有较高特异性[30]。相对于传统PCR而言其不受仪器的限制，RAA 法还可以应用于大量样品的快速检测。

4.6 重组酶聚合酶扩增技术重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一种被看作可以替代甚至超越 PCR的核酸扩增技术。RPA技术具有：可在37 ℃～42 ℃恒温条件下进行核酸扩增、可5～20 min完成检测、可同时快速检测多种样品、特异性好、灵敏度高等优点[31]。在寄生虫检测方面，张春玲等人[32]通过华支睾吸虫囊蚴的COX-1基因序列设计了引物，建立了检测华支睾吸虫囊蚴的RPA方法，灵敏度可达到2.75 ng/μL，并且可在35 ℃下5 min内观察到检测结果，从其高特异性和高灵敏度方面来看，非常适合现场寄生虫检测。但是RPA技术必须对粪便样本中的华支睾吸虫DNA进行纯化，还需要较长的引物和探针，不宜控制检测大量样品反应的同时进行[33]。而且目前还没有专业的软件可以进行RPA引物设计，主要靠大量合成与筛选[34]。从成本上来看，相对于PCR和LAMP，RPA技术诊断华支睾吸虫病仍存在优势。

5 联合诊断

单一的检查方法对肝吸虫病诊断的准确度有限，联合诊断对提高其灵敏度和特异性发挥着很大的作用。杨绮红等人[35]对可疑华支睾吸虫感染者制定了一套联合诊断策略，首先检测血清肝吸虫抗体（ELISA试验），对抗体阳性者进一步行病原学检测粪便虫卵，若是虫卵阴性则建议行胃镜引导下十二指肠液引流术，从引流液中查找虫卵，这进一步提高了华支睾吸虫病的检出率。ELISA法联合粪便检查，两种诊断方法相结合对华支睾吸虫病诊断的敏感度、特异性与准确率也明显优于单一的粪便检查、ELISA检查，误诊率和漏诊率也均低于单一检测[36～37]。在对华支睾吸虫病患者进行影像学诊断时，若符合B型超声波检查的特征，规定还需要进行华支睾吸虫病的病原学检查项目。特别是对于华支睾吸虫病合并其他寄生虫感染的病例[38]，更应结合使用形态学、血清学、影像学和分子生物学等方法进行鉴别诊断，以便进一步治疗。

6 结语

综上所述，随着科学技术的飞跃发展，分子生物学技术应用于华支睾吸虫病的鉴别诊断方面变得更加广泛，研究出灵敏度高、特异性强、可重复性好、操作简易方便、反应快速和经济实用的突破性诊断技术仍是需要关注的热点。本综述主要对华支睾吸虫病的分子生物学诊断技术进行了详细的梳理，认为病原学粪检虫卵和免疫学诊断应用较为广泛，临床上应用影像学诊断技术更多的是为后续诊治提供策略，为了检测的高灵敏度和高特异性可以进行联合诊断，但工作会更加繁琐，以上内容将为华支睾吸虫病诊断和后续治疗提供参考依据。参考文献[1] XU M，JIANG Y Y，YIN J H，et al.Risk factors for clonorchis sinensis infection in residents of Binyang，Guangxi：a cross-sectional and logistic analysis study[J].Front Public Health，2021，9：588325.

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（收稿日期：2022-03-17修回日期：2022-03-22）

（编辑：梁明佩）