HER2阳性浸润性乳腺癌新辅助治疗反应的预测因子及治疗前后HER2状态变化的评估

刘建兰，陈黛诗，胡 泓，周冬仙，胡锦涛

1.深圳市人民医院（暨南大学第二临床医学院，南方科技大学第一附属医院）病理科，广东 深圳 518020；2.深圳市人民医院（暨南大学第二临床医学院，南方科技大学第一附属医院）耳鼻咽喉科，广东 深圳 518020；3.深圳市人民医院（暨南大学第二临床医学院，南方科技大学第一附属医院）甲乳外科，广东 深圳 518020

15%～20%的浸润性乳腺癌为人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性，表现为HER2基因扩增或蛋白过表达，HER2阳性乳腺癌的侵袭性强，患者预后较差［1］。然而，HER2特异性单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，以及以恩美曲妥珠单抗为代表的抗体药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）的出现，显著降低了早期HER2阳性乳腺癌的复发率［2-3］。有研究［4］显示，HER2阳性乳腺癌患者术前新辅助治疗达到病理学完全缓解（pathological complete response，pCR）后生存获益更好，因此，新辅助治疗方案的选择是在追求毒性可控的前提下获得更高的pCR率。新辅助化疗联合HER2靶向治疗，由于其与pCR率有关，常被用于治疗HER2阳性乳腺癌［5］。

HER2 阳性定义为免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）3+或HER2基因扩增，是抗HER2靶向治疗的主要预测指标和有效的生物标志物。荧光原位杂交（fluorescencein situhybridisation，FISH）是评估HER2基因扩增的常规方法，无论是HER2 IHC 3+或IHC 2+组FISH阳性的乳腺癌患者，都可以接受抗HER2靶向治疗，因此正确检测和评定乳腺癌的HER2蛋白表达和基因扩增状态，并选择适合抗HER2靶向治疗的乳腺癌患者对临床治疗及预后判断至关重要。随着HER2检测的广泛应用，HER2异质性逐渐被认识，尽管HER2靶向药物可以显著改善HER2阳性乳腺癌患者的预后，但耐药性仍然是一个重大挑战。耐药的一个潜在机制是肿瘤内治疗靶点的异质性表达，HER2异质性被认为是抗HER2靶向治疗的耐药机制之一。因此，了解肿瘤内异质性如何影响靶向治疗的反应非常重要。本研究旨在确定各临床病理学因素尤其是抗HER2异质性对HER2阳性乳腺癌新辅助治疗反应的影响，并进一步评估新辅助治疗前后HER2状态的变化。

1 资料和方法

1.1 研究对象

收集深圳市人民医院2019—2021年经术前空芯针活检确诊的110例HER2阳性乳腺癌患者，经新辅助治疗后行手术切除。所需临床病理学资料均来自医院电子病历资料库。

1.2 方法

所有标本经4%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋制片，H-E染色，在光镜下观察。IHC染色采用EnⅤision两步法。雌激素受体（estrogen receptor，ER）、Ki-67的检测试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司，孕激素受体（progesterone receptor，PR）、HER2的检测试剂盒购自美国Roche公司。IHC均常规设置阳性和阴性对照。操作步骤按说明书进行。

1.3 判读结果

ER、PR及Ki-67免疫染色阳性均定位于细胞核，HER2免疫染色阳性定位于细胞膜。ER、PR表达结果的判读根据中国乳腺癌专家组推荐的《乳腺癌雌、孕激素受体免疫组织化学检测指南》［6］：阳性细胞数≥1%为阳性。HER2抗体按照《乳腺癌HER2检测指南（2019版）》［7］进行判读，HER2 IHC检测结果为2+时，采用FISH HER2探针进行HER2基因扩增分析。HER2异质性评价：HER2 IHC表达3+时，弥漫100% 3+视为无异质性，否则视为具有异质性。

1.4 残余肿瘤负荷（residual cancer burden，RCB）分级评估

根据美国MD Anderson癌症中心提出的RCB分级系统［8］，计算乳腺癌新辅助治疗后的RCB评分。RCB-0：RCB值=0.00，pCR（乳腺原发灶无浸润性癌且区域淋巴结无癌细胞）；其余则视为非病理学完全缓解（non-pathological complete response，non-pCR）。RCB-Ⅰ：0.00＜RCB值≤1.36，肿瘤少量残余；RCB-Ⅱ：1.36＜RCB值≤3.28，肿瘤中等量残余；RCB-Ⅲ：RCB值＞3.28，肿瘤广泛残余。

所有患者均接受化疗及靶向治疗，根据接受的新辅助治疗类型分为两组：①化疗联合曲妥珠单抗单靶治疗；② 化疗联合曲妥珠单抗及帕妥珠单抗双靶治疗。给予的化疗方案均为个体化方 案。

1.5 统计学处理

采用SPSS 23.0软件对数据进行分析，计量资料采用χ2检验。应用logistic回归模型分析各变量对pCR的影响。如果一个变量保持在P＜0.2的水平，则将其纳入最终的多变量模型。通过Wilcoxon检验和McNemar检验比较新辅助治疗前后的HER2、ER和PR状态变化。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HER2异质性、RCB分级与临床病理学特征的相关性

110例患者均为女性，确诊时中位年龄为48岁（25～72岁）。除1例为浸润性小叶癌（invasive lobular carcinoma，ILC）外，其余均为浸润性非特殊类型癌（no special type，NST）。新辅助治疗前穿刺标本中HER2 IHC 3+组101例（91.8%），HER2 IHC 2+组9例（8.2%），HER2 IHC2+均经FISH检测证实基因扩增。进一步将HER2 IHC 3+组根据HER2有无异质性分为弥漫3+组（81例，73.6%）和异质性3+组（20例，18.2%）。80.0%（16/20）异质性3+病例为激素受体（hormone receptor，HR）阳性。

新辅助治疗前HER2表达与年龄、ER、PR、肿瘤大小、Ki-67增殖指数、淋巴结转移、组织学类型及治疗方案均无相关性（表1）。术后RCB分级高与ER、PR阳性相关，差异有统计学意义（P＜0.05），而与年龄、肿瘤大小、Ki-67增殖指数、淋巴结转移、组织学类型及治疗方案无相关性（表2）。ER、PR阴性组的pCR率均明显高于ER阳性组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 HER2异质性与临床病理学特征的关系Tab.1 The correlation between HER2 and clinicopathological characteristics

表2 RCB分级与临床病理学特征的关系Tab.2 The correlation between RCB and clinicopathological characteristics

2.2 HER2异质性与pCR的相关性

41.8 %的患者达到pCR（RCB-0）。HER2弥漫3+组pCR率为54.3%（44/81），而异质性3+组为5.0%（1/20），2+FISH+组为11.1%（1/9），差异有统计学意义（P＜0.001，图1）。HER2 3+组总pCR率［44.6%（45/101）］明显高于2+FISH+组［11.1%（1/9）］，差异有统计学意义（P＜0.001）。

图1 HER2异质性与pCR率的相关性Fig.1 The correlation between HER2 heterogeneity and pCR rate

46例达到pCR的患者中，大部分（95.7%）为HER2弥漫3+组（44例），另有异质性3+组1例，2+FISH+组1例。64例non-pCR患者中RCB分布：RCB-Ⅰ为20%（22/110），RCB-Ⅱ为26.4%（29/110），RCB-Ⅲ为11.8%（13/110）。RCB-Ⅰ组大部分（77.3%）为HER2弥漫3+病例，而异质性3+及2+FISH+组的RCB分级更高。

2.3 pCR的相关预测因素

通过单变量和多变量逐步回归模型分析各临床病理学参数与pCR的相关性。在所有HER2阳性乳腺癌患者中，单因素分析结果显示，HER2异质性、ER、PR表达与pCR相关（P均＜0.05），多因素分析结果显示，HER2弥漫3+是pCR的独立预测因子（OR=6.912，95% CI：2.048～23.329，P=0.002，表3）。在IHC弥漫3+组中，pCR与研究的任何因素均无相关性（表4）。其他两组样本量相对较少，未单独进行回归分析。

表3 HER2阳性乳腺癌中pCR相关单因素与多因素回归分析Tab.3 Univariate and multivariate logistic regression for pCR in HER2 positive breast cancer

表4 HER2弥漫3+乳腺癌中pCR相关单因素与多因素回归分析Tab.4 Univariate and multivariate logistic regression for pCR in HER2 diffuse 3+breast cancer

2.4 新辅助治疗前后HER2、ER及PR状态的一致性比较

在64例non-pCR患者中，对新辅助治疗后残留癌灶中的59例HER2状态、60例ER状态及59例PR状态进行评估。7例（11.9%）在新辅助治疗后HER2转为阴性（IHC 2+且FISH-或IHC 0/1+），其中1例为弥漫3+，3例异质性3+，3例2+FISH+，差异有统计学意义（P＜0.001，表5）。4例（6.7%）在新辅助治疗后ER状态发生改变，43例ER阳性患者中2例（4.7%）在治疗后转为阴性；而17例ER阴性患者中2例（11.8%）在治疗后转为阳性。13例（22%）在新辅助治疗后PR状态发生改变，46例治疗前PR阳性患者治疗后9例（19.6%）转为PR阴性，13例治疗前PR阴性患者治疗后4例（30.8%）转为PR阳性，但差异无统计学意义（P＞0.05）。然后根据不同的HER2类别评估新辅助治疗前后HER2状态的一致性，IHC弥漫3+组一致性最高（97.1%，33/34），其次为IHC异质性3+组（83.3%，15/18），IHC 2+FISH+组最低（57.1%，4/7）。7例IHC HER2 3+患者新辅助治疗后转为2+，其中6例患者新辅助治疗前为异质性3+（FISH检测结果：3例阳性，2例阴性，1例未做），1例为弥漫3+（未行FISH检测）。

表5 新辅助治疗前后HER2、ER及PR状态比较Tab.5 Comparison of HER2,ER and PR status between pre-and post-neoadjuvant treatment

3 讨论

HER2阳性乳腺癌对新辅助化疗和靶向治疗的反应并不一致，虽然同为HER2阳性，但部分患者反应较差，本研究应用最基本、最简单易行的IHC评估肿瘤内部存在的HER2表达的异质性，评价其与新辅助治疗反应的相关性。

本研究的101例HER2 IHC 3+乳腺癌患者中，19.8%具有HER2异质性，其中80.0%为HR阳性。当接受抗HER2靶向治疗时，HER2 IHC 3+比2+FISH+乳腺癌有更高的pCR率，这与之前的报道［9］一致。本研究中，HER2 IHC 3+乳腺癌的pCR率为44.6%，在之前的临床试验［10-11］报告的范围内，而HER2 3+乳腺癌中HER2异质性3+组的pCR率（5.0%）明显低于弥漫3+组（54.3%）。HER2异质性与pCR显著相关，是一个强有力的预测因子，可能被用于优化治疗选择。进一步多因素回归分析显示，HER2弥漫3+是HER2阳性乳腺癌新辅助治疗后pCR的独立预测因子，HER弥漫3+时，pCR与其他任何因素均无相关性，凸显了HER2蛋白表达水平在预测HER2阳性乳腺癌对新辅助治疗反应中的重要性。IHC检测简单易行，成本相对较低，染色玻片易于保存，常规报告中应在尽可能准确的情况下对HER2 IHC染色进行异质性评价，可为临床诊治提供额外有价值的信息。

作为HER2阳性乳腺癌治疗的靶点，HER2基因扩增水平如FISH检测中的HER2基因拷贝数、HER2/CEP17比值对新辅助治疗反应的影响是目前研究的热点。然而，文献中存在相互矛盾的观点，不同研究中HER2基因拷贝数的截断值也各不相同。目前认为，HER2阳性乳腺癌中较高的HER2基因拷贝数及HER2/CEP17比值与较好的预后相关，可以作为新辅助治疗反应的预测指标，但仍需要进一步验证，另外，还需要仔细评估CEP17状态，HER2基因拷贝数的最佳截断值也有待于进一步研究。但有文献［12］报道，在IHC 2+FISH+组中，pCR率与HER2基因拷贝数及HER2/CEP17比值无明显相关性。而且，在IHC 2+组中，当HER2/CEP17比值≥2.0时，HER2基因拷贝数＜4.0亚组与≥4.0亚组（或该亚组加HER2/CEP17比值＜2.0且HER2基因拷贝数≥6.0亚组），pCR率差异无统计学意义［13］。Filho等［14］研究发现，HER2异质性小的患者HER2水平较低且一致，异质性大的患者则具有更高的HER2拷贝数，non-pCR患者具有更高比例的HER2非扩增细胞。靶向治疗提高了HER2阳性乳腺癌的治愈率，表明在一部分患者中可以避免化疗。HER2异质性，特别是HER2非扩增细胞的比例是HER2治疗耐药性的一个强有力的预测因子，并可能用于优化治疗选择。能否通过HER2扩增水平实现HER2阳性乳腺癌患者治疗的降级与升级仍需要大样本临床试验的探索。

HR状态会影响乳腺癌对新辅助化疗和抗HER2治疗的敏感性。因为HER2阳性、HR阴性乳腺癌的生长可能高度依赖HER2基因，这些肿瘤通常对于抗HER2治疗表现出良好的反应［15］。本研究结果显示，ER、PR阳性时RCB分级更高，HR阴性组pCR率（65.5%）明显高于HR阳性组（33.3%）。在HER2 3+组中，HR阴性组pCR率为64.3%，高于HR阳性组的32.5%。在异质性3+组中，HR阳性组没有pCR，仅1例HR阴性患者获得pCR，在2+FISH+组中也是如此。由此可见，无论在HER2 IHC 3+组还是2+FISH+组中，HR阴性组的pCR率明显高于HR阳性组。回归分析提示HR阴性与pCR相关，而弥漫3+组pCR与HR无相关性，异质性3+及2+FISH+组与HR的关系则需要更多的病例来证实。最新文献［16］报道，在2+FISH+组中ER阴性被确定为pCR的独立预测因子。此前有研究［17］显示，HER2 IHC 3+与2+FISH+肿瘤的病理学特征不同，IHC 3+肿瘤往往具有较高的组织学分级，肿瘤通常较大，ER、PR通常为阴性。按照当前的HER2分组，HR与HER2无明显相关性，但当HR以10%为临界值时，与其他两组相比，HER2弥漫3+组的ER更多为阴性或低表达（P＜0.05）。这些研究强调了综合考虑HER2和HR状态的重要性，以选择最有可能受益于新辅助抗HER2治疗的患者。尽管在HER2阳性/HR阳性乳腺癌中pCR的发生率较低，但这类肿瘤患者预后良好，因此，在HER2阳性/HR阳性肿瘤中pCR与长期预后的相关性较HER2阳性/HR阴性肿瘤弱［18-19］。然而，HER2阳性/HR阳性患者的新辅助内分泌治疗并没有显著改善其pCR率，需要进一步的研究来改善HER2阳性/HR阳性乳腺癌患者的预后。本研究结果显示，HR作为HER2阳性乳腺癌中pCR的影响因素，对HER2弥漫3+组无明显影响，从而进一步强调了评价HER2异质性的重要性。

本研究结果证实，一小部分病例新辅助治疗后HER2、ER和PR状态发生变化，文献［16，20］报道的比例各不相同。新辅助治疗后HER2转为阴性时HER2状态的变化差异有统计学意义（P＜0.05），可能提示肿瘤内部HER2存在异质性，HER2阳性肿瘤细胞对化疗和靶向治疗有效，残留HER2阴性肿瘤细胞。然而，值得注意的是，这部分患者大部分（85.7%）为异质性3+或IHC 2+FISH+患者，弥漫3+组HER2状态的改变极少。目前尚不清楚HER2转为阴性是肿瘤对治疗的反应、耐药机制还是HER2异质性。有研究［20-21］显示，与新辅助治疗后HER2仍然阳性的肿瘤相比，残留病灶中HER2阴性的肿瘤与较差的预后相关。在新辅助抗HER2治疗后，Luminal A型是残留病灶中最常见的亚型。建议应尽可能在新辅助治疗后的手术标本中重新检测HER2状态，特别是在HER2具有异质性的肿瘤中，少部分HR阴性患者新辅助治疗后变为HR阳性，因此，对于新辅助治疗后ER、PR及HER2状态的重新评估将有助于进一步治疗决策的选择。

虽然本研究中HER2异质性3+及2+FISH+组样本量较小，然而，HER2 IHC弥漫3+与pCR高度相关证实了IHC在评估HER2表达中的关键作用，且与具有较大样本量的报道［16］一致，HER2 IHC 3+组pCR与研究的其他任何因素无相关性，IHC 2+FISH+组ER阴性是独立预测因子，本研究中该组仅1例HR阴性患者获得pCR，证明了本研究结果的可靠性。至于HER2异质性3+组，文献报道较少，可能因为大部分IHC 3+病例为弥漫3+，从而忽略了这部分病例，这一组病例具有更高的RCB分级，预后较IHC弥漫3+组差［22］。因此，有必要将这组病例从IHC 3+组中区分开来，从而使患者获得更精准的治疗，本研究中该组仅1例HER2 IHC＞50%的HR阴性患者获得pCR，HER2高表达或HR阴性可能与该组患者的pCR相关，还需要更多的病例来证实。有研究［14］发现，HER2异质性与较差的预后和较低的抗HER2治疗反应有关，因此如何定义HER2异质性，如何为具有异质性的患者选择最佳治疗方案，需要给出一个统一的、可重复的关于HER2异质性的定义。

评价HER2异质性有助于新的抗HER2靶向药物的开发，最近提出了HER2低表达的定义：IHC示1+或2+且FISH检测阴性。约高达50%的乳腺癌会被归类为HER2低表达，这些肿瘤不能从曲妥珠单抗治疗中获益，然而新的抗HER2治疗，特别是ADC如DS-8201（T-DXd）已证明对HER2过表达或低表达的肿瘤均可发挥作用［23］。这些新型ADC通过肿瘤细胞膜上最低限度的HER2受体发挥作用，而且具有强大的旁观者效应，可将药物扩散到邻近的肿瘤细胞甚至HER2阴性的肿瘤细胞内产生杀伤作用。这类新型ADC的出现，可能使HER2具有异质性的这部分乳腺癌患者极大获益。因此应该开始重视IHC HER2阴性及阳性表达中异质性的评价。

鉴于HER2异质性评价对HER2表达（高表达、低表达）乳腺癌的重要意义，建议在日常HER2 IHC评价时应分别报告HER2阳性百分比及阳性强度（0、1+、2+和3+）；联合IHC及FISH结果综合评价HER2表达情况，更好地选择HER2靶向治疗患者，更准确地评估新辅助治疗效果及预后。结合本研究结果，认为HER2 IHC≥50%3+为高表达组，新辅助治疗的pCR率高，IHC＜50% 3+及IHC 2+FISH+应归为低表达组，新辅助治疗的pCR率低，DS-8201等ADC成为新的选择。

综上所述，HER2异质性会影响HER2阳性乳腺癌对新辅助治疗的反应，HER2弥漫3+患者新辅助治疗后pCR率最高，且与其他因素无明显相关性。约11.9%的HER2阳性乳腺癌患者在新辅助治疗后变为HER2阴性，在HER2 IHC异质性3+及2+FISH+肿瘤中更为常见。对于新辅助治疗后HER2、ER及PR状态的重新评估将有助于进一步辅助治疗决策的选择。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。