镉胁迫下锌硒交互作用对水稻镉毒害的缓解机制

2022-06-09呼艳姣陈美凤强瑀李海燕刘静秦樊鑫

生物技术通报 2022年4期

呼艳姣陈美凤强瑀李海燕刘静秦樊鑫

（1.贵州师范大学生命科学学院，贵阳 550025；2.贵州师范大学贵州省植物生理与发育调控重点实验室，贵阳 550025）

随着现代社会经济的高速发展，工业活动使大量的镉排放到环境中，造成环境镉污染严重［1］。镉是一种具有较高生物毒性、迁移能力强的重金属［2］。经研究发现，水稻对镉的富集作用极强，不仅会使水稻的产量降低，更严重的是会通过食物链进入人体从而影响人体健康［3-5］。近年来稻米镉含量超标现象时常发生，反映出镉污染形势的严峻［6］。2020年“中央一号”文件提出推进农用地土壤污染管控和修复利用［7］，由此可见镉米问题的解决已刻不容缓。

目前，许多科研人员对水稻镉积累［8-9］、吸收转化机制［10］，以及镉胁迫下水稻的生理生化变化［11］做了相关研究。为进一步缓解水稻镉积累的毒害，有研究者添加其他元素来探讨对镉胁迫水稻的影响，例如采用硫［12-13］、磷［14］、镧［15］、硅［16］均可缓解水稻对镉的积累。张云慧等［17］发现锌能控制根表铁膜的形成来影响水稻吸收镉。朱秀红等［18］研究白花泡桐幼苗在锌、镉胁迫下的生理生化响应，结果表明加入锌会缓解镉对植株生长的抑制作用及镉造成的膜质过氧化伤害，锌镉表现为拮抗作用。Huang等［19］发现施硒可减轻水稻中镉诱导的氧化胁迫；梁欢婷等［20］、刘永贤等［21］也发现通过叶面施硒均可有效降低稻米镉含量。可见，锌和硒可以缓解植物镉毒害，然而同时添加锌、硒对水稻镉毒害影响如何，目前研究尚未报道。本试验以南粳9108为研究对象，通过萌发试验和水培试验来探讨锌硒对镉胁迫下水稻种子萌发、幼苗生长及不同部位镉含量的影响，从而揭示锌、硒、锌硒交互作用对水稻镉毒害的缓解机制，为缓解水稻镉毒害提供理论依据和实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试水稻为南粳9108（苏审稻201306），属迟熟中粳水稻品种，由江苏省农业科学院粮食作物研究所采用武香粳14号与关东194杂交育成。

试剂：氯化镉（CdCl2·2.5 H2O）、亚硒酸钠（Na2O2Se）、硫酸锌（ZnSO4·7 H2O）、过氧化氢（H2O2）、硝酸（HNO3）、霍格兰（Hoagland）营养液、无水乙醇（CH3CH2OH）、氯化钠（NaCl）、醋酸（CH3COOH）、盐酸（HCl）。

1.2 方法

1.2.1 萌发试验选取适量籽粒饱满、均匀的水稻种子，用30%过氧化氢浸泡15 min消毒，再用去离子水反复冲洗3次后铺放在培养皿上。按以下镉浓度进行处理：对照组CK（0 mg/L），Cd0.1（0.1 mg/L），Cd0.5（0.5 mg/L），Cd1（1.0 mg/L），Cd2（2.0 mg/L），Cd4（4.0 mg/L），Cd8（8.0 mg/L），Cd10（10.0 mg/L）；另外不同浓度镉锌硒处理，镉浓度5.0 mg/L记Cd5，锌浓度5.0 mg/L、10.0 mg/L，记Zn5、Zn10，硒浓度1.0 mg/L、5.0 mg/L，记Se1、Se5。共设置8个处理组：CK，Cd5，Cd5+Zn5，Cd5+Zn10，Cd5+Se1，Cd5+Se5，Cd5+Zn5+Se1，Cd5+Zn10+Se5。以上每个处理3个重复，空白为去离子水处理，种子遮光催芽1 d后，放入光照培养箱中培养7 d，光照 12 h，28.0℃，黑暗 12 h，25.0℃，湿度 90.0%。

1.2.2 水培试验将水稻培养到四叶一心期时，移栽至一系列添加镉、锌、硒的营养液中。镉添加浓度为0、0.5 mg/L，记CK、Cd0.5；锌添加浓度为0、1.0 mg/L，记Zn0、Zn1；硒添加浓度为0、0.1 mg/L，记Se0、Se0.1。共7个处理：CK、Cd0.5、Zn1、Se0.5、Cd0.5+Zn1、Cd0.5+Se0.5、Cd0.5+Zn1+Se0.5。培养在2 L的聚苯乙烯泡沫箱中，每盆放置6株水稻，设置3个重复置于光照培养箱（光照 12 h，32.0℃，黑暗12 h，25.0℃，湿度 90.0%）。

1.2.3 测定项目与方法发芽试验第3天统计发芽势，第7天统计发芽率、幼根长、幼芽长、根鲜重、芽鲜重。发芽势=（调查时间内（3 d）的种子发芽数/供试种子总数）×100%；发芽率=发芽种子数/供试种子总数；幼根长和幼芽长：取幼根和幼芽最长的5个种子，取平均值；发芽指数=不同天的种子发芽数/发芽天数；活力指数=发芽指数×幼芽长度或幼芽重量（取幼根长）；幼苗的根鲜重与芽鲜重用天平称量，按每皿计算。将根和芽分别装入信封中，于烘箱中105℃杀青15 min，70℃烘干至恒重，记录根和芽的干重，研磨后称取样品于聚四氟乙烯消解罐中，加入9 mL硝酸和1 mL过氧化氢放置过夜，再用电热板进行消解，过滤定容后用ICP-MS测定镉元素的含量。测定过程中采用生物成分分析标准物质NCS 202006（665#）菠菜和空白样品进行全程质量控制。

水稻胁迫水培30 d后，用叶绿素仪（Konica Minolta Sensing，SPAD-502 Plus）测定叶绿素值。测量水稻株高、根长，分离地上部和地下部，测量鲜重。取3-6片完全展开叶，记录鲜重m1，将叶片放入试管中用自来水浸泡2 h后称重m2，置于60℃干燥箱10-15 h，称量干重m3，计算相对含水量。另部分鲜样分成根、茎、叶，样品同上述方法进行烘干、研磨、消解，测定镉含量。

1.2.4 数据处理与分析用Excel 2016统计数据，SPSS 24.0进行LSD显著性差异分析，Origin 2019绘制图。

2 结果

2.1 锌硒对镉胁迫下水稻种子萌发的影响

2.1.1 不同浓度镉对水稻种子萌发的影响由表1可知，随着镉浓度的升高，水稻种子的发芽势、发芽率、根鲜重、芽鲜重、幼根长、幼芽长、发芽指数、活力指数均呈现出先升高后降低的趋势。低浓度镉处理对种子萌发的各项生理指标均产生不同程度的促进作用；高浓度镉处理则会产生不同程度的抑制作用。Cd1处理下，对萌发各生理指标的促进作用最强，与对照相比，水稻种子的各项生理指标（按上述顺序）分别提高了0.54%、15.25%、29.17%、46.88%、18.45%、6.64%、0.79%、19.05%。Cd10处理时，与对照相比，种子各项生理指标分别降低了63.74%、43.22%、50%、15.63%、60.84%、6.64%、60.58%、63.74%，且除幼芽长外，其他生理指标均和对照间差异显著。由此可见，低浓度镉促进萌发，高浓度镉抑制萌发。

2.1.2 锌硒对镉胁迫下水稻种子萌发的影响由表1可知，与对照相比，Cd1处理下水稻种子萌发的各项生理指标优势明显，Cd2处理下水稻种子萌发各生理指标几乎与对照持平，差异均不显著，Cd4处理下种子萌发各生理指标与对照相比显著降低。综合各生理指标考虑，选择镉浓度在（4-10）mg/L内既可以产生镉毒害抑制种子萌发生长，又可以防止镉毒害过重致使种子失活，因此本试验选择镉浓度为5 mg/L来研究锌硒对镉胁迫下水稻种子萌发的适宜浓度。如表2所示，与对照相比，经该浓度的镉处理后水稻种子的各项生理指标显著降低，表明较高浓度的镉可以显著抑制水稻种子萌发生长，对水稻种子产生毒害作用；而且在镉胁迫下添加不同浓度锌时，水稻种子的各项生理指标同样显著降低。与镉处理相比，水稻种子萌发的各项生长发育指标优势明显，且差异显著，表明添加锌可以缓解镉对水稻种子萌发生长的抑制作用；与镉处理相比，在镉胁迫下添加不同浓度硒时，除Se1处理幼根指标外，硒处理使种子各项生理指标显著降低，表明硒会加重镉对水稻种子萌发的抑制作用；在镉胁迫下添加不同浓度锌硒组合时，在Cd5+Se5+Zn10处理下，与镉处理相比，种子发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数均显著升高，在Cd5+Se1+Zn5处理下，种子各项生理指标均明显降低，除幼根长差异不显著外，其他生理指标均差异显著。试验结果表明在5 mg/L镉浓度下，同时添加5 mg/L硒和10 mg/L锌可有效促进种子萌发，但不能促进根和芽的生长；而同时添加1 mg/L硒和5 mg/L锌则不能有效缓解镉对水稻种子萌发生长的抑制作用。

表1 不同浓度镉处理对水稻种子萌发及生长的影响Table 1 Effects of different concentrations of cadmium on the germination and growth of rice seed

表2 不同锌硒镉浓度对水稻种子萌发和生长的影响Table 2 Effects of different concentrations of zinc，selenium and cadmium on the germination and growth of rice seed

2.1.3 锌硒对水稻幼苗镉含量的影响如图1所示，不同浓度镉对水稻幼根和幼芽镉积累呈显著性正相关（r幼根=0.993，r幼芽=0.973，P＜0.05），表明在本试验条件下，随着镉处理浓度的增加，水稻幼根和幼芽镉含量也明显增加。当镉胁迫下分别添加不同浓度锌、硒及同时添加锌硒时，与镉处理相比，Zn5、Zn10处理使水稻幼根镉含量分别降低12.19%、2.79%，幼芽镉含量分别降低35.14%、35.21%；Se1、Se5处理使水稻幼根镉含量分别降低1.01%、16.76%，幼芽镉含量分别降低2.18%、40.26%；Cd5+Se1+Zn5、Cd5+Se5+Zn10处理使水稻幼根镉含量分别降低9.77%、6.87%，幼芽镉含量分别降低22.54%、8.48%。结果表明，在镉胁迫下分别添加锌、硒和同时添加锌硒的情况下，均会降低水稻幼根和幼芽中的镉含量，除Se1处理外，其余浓度处理差异均极显著，幼芽镉含量的降幅均显著高于幼根镉含量的降幅；与分别添加锌、硒相比，同时添加不同浓度锌硒会有效降低Se1处理下镉含量，而且提高Zn10处理下镉含量，并且可抑制锌对水稻幼根和幼芽的缓解作用。

图1 不同处理对水稻种子幼根幼芽镉含量的影响Fig.1 Effects of different treatments on the cadmium content in the young roots and shoots of rice seed

2.2 锌硒对水稻生长发育的影响

由表3可知，与对照相比，单一元素处理时，Cd0.5、Se0.5处理分别使水稻根长降低了15.38%、2.20%，Zn1处理使水稻根长显著提高了25.27%；与 Cd0.5处理相比，Cd0.5+Zn1、Cd0.5+Se0.5、Cd0.5+Zn1+Se0.5处理分别使水稻根长提高了38.96%、23.38%、7.14%，表明单一元素处理时，锌可使水稻根长显著增加，硒对水稻根长无显著影响，镉导致水稻根长显著降低；与镉处理相比，镉胁迫下分别添加锌、硒和同时添加锌硒均使水稻根长增加，分别添加锌、硒的效果显著，同时添加锌硒的效果不显著。与对照相比，单一元素处理时，Cd0.5、Se0.5、Zn1处理分别使水稻株高降低了36.60%、18.29%、1.43%；与Cd0.5处理相比，Cd0.5+Zn1、Cd0.5+ Se0.5处理分别使株高显著增加了11.41%、21.52%，Cd0.5+Zn1+Se0.5处理使株高显著降低了22.59%。表明单一元素处理时，镉、锌均使水稻株高显著降低，锌效果不显著；与镉处理相比，在镉胁迫下分别添加锌、硒均使株高显著增加，但同时添加锌硒会显著降低株高。

表3 不同锌硒镉浓度对水稻生长和生理指标的影响Table 3 Effects of different concentrations of zinc，selenium and cadmium on the growth and physiological indexes of rice

与对照相比，单一元素处理时，Cd0.5、Se0.5、Zn1处理使叶片相对含水量分别降低了16.08%、7.72%、0.46%，SPAD值分别降低了33.29%、7.50%，但Zn1处理使SPAD值提高了2.95%。结果表明单一元素处理时，锌对水稻相对含水量和SPAD值无显著影响，镉、硒均导致水稻相对含水量和SPAD值降低，其中水稻相对含水量和SPAD值受镉毒害影响较大；与Cd0.5处理相比，Cd0.5+Zn1、Cd0.5+Se0.5处理后叶片相对含水量分别显著提高了8.98%、17.05%，Cd0.5+Zn1+Se0.5处理后叶片相对含水量降低了1.64%；Cd0.5+Zn1、Cd0.5+Se0.5处理后SPAD值分别显著提高了29.23%、11.35%，Cd0.5+Zn1+Se0.5处理后SPAD值显著降低了16.32%。结果表明在镉胁迫下添加锌、硒均可显著提高叶片相对含水量和SPAD值，但同时添加锌硒会显著降低SPAD值。

2.3 锌硒对水稻镉累积的影响

水稻各器官中镉含量的分布特征为：根＞茎＞叶，由此可见，根部是吸收积累镉的主要部位。不同处理对水稻根、茎、叶各部位镉含量的影响如图2所示，与Cd0.5处理相比，Cd0.5+Zn1、Cd0.5+Se0.5、Cd0.5+Zn1+Se0.5处理均可导致水稻各部位镉含量降低，经各上述顺序处理后根系镉含量分别显著降低了10.63%、12.60%、27.18%，茎中镉含量分别降低了9.58%、58.45%、47.97%，叶中镉含量分别显著降低了27.41%、63.82%、44.46%。结果表明，在镉胁迫下分别添加锌、硒和同时添加锌硒均显著降低镉在根、茎、叶中的累积，其中，同时添加锌硒对降低水稻根系镉含量效果较好。由表4可知，Cd0.5+Se0.5、Cd0.5+Zn1+Se0.5处理均显著降低镉由根系向茎的转运系数和根系向叶片的转运系数，而Cd0.5+Zn1处理对镉转运系数的影响不明显。

表4 不同处理对镉在水稻体内转运的影响Table 4 Effects of different treatments on the cadmium transport in rice

图2 不同处理对水稻根、茎、叶各部位镉含量的影响Fig.2 Effects of different treatments on the cadmium content in the roots，stems and leaves of rice

3 讨论

3.1 锌硒对镉胁迫水稻种子萌发及镉积累的影响

本试验结果表明，低浓度镉可促进水稻种子萌发，高浓度镉则起抑制作用。其中，高浓度镉对水稻种子的根长和根鲜重抑制效果显著，而对幼芽长抑制效果却不显著。其原因可能是种子的根是最先接触镉的部位，所以根是镉胁迫的最敏感的反应部位。这种低促高抑的现象与多位研究学者的试验结果一致［22-26］。锌、硒是维系植物生长过程中必需的微量元素，在镉胁迫下添加锌或硒时，适宜浓度锌可以缓解镉对种子萌发的毒害作用，而硒则加重对种子萌发的毒害作用。前人的研究表明［27-29］，在一定锌浓度范围内，锌可以刺激种子萌发；低浓度硒可参与细胞防御机制，对水稻细胞膜有保护作用，降低了植物体内镉诱导的活性氧自由基，促进早期种子萌发，但高浓度的硒会促进过氧化作用，抑制种子内淀粉酶、蛋白酶活性，从而影响种子萌发所需要的物质和能量［30］，与本试验硒处理结果有差异可能是因为硒浓度相较镉浓度而言设置较高，而且对于不同的植物种类，硒能产生抑制作用的阈值和硒镉计量比也存在差异。当镉胁迫下加入适宜浓度的锌硒时可促进种子萌发，有效缓解镉对种子萌发的抑制作用，但不能促进根系和芽的生长。其原因可能是萌发后的胚芽较黄，此情况虽计入萌发，但发芽率已不能良好地体现种子受抑制程度，而根长则能比较准确的反映抑制情况［31］。锌硒镉交互作用机制比较复杂，还需要通过更精确的浓度范围进一步探讨锌硒对镉胁迫下水稻种子的萌发机制。

本研究发现镉浓度与水稻幼苗镉累积量呈显著正相关，当在镉胁迫下分别添加锌、硒和同时添加锌硒均可不同程度降低幼芽和幼根中的镉含量，且幼芽镉含量的降幅均大于幼根镉含量的降幅，说明在萌发短期内分别添加锌、硒和同时添加锌硒均可以减少镉在水稻种子中的累积，对幼芽的缓解程度明显大于幼根。这与前人的相关研究结论大致相同［32］，与赵萍等［33］的锌促进镉向地上部分运输结论有差异。这可能与本试验锌和镉的浓度以及水稻品种不同有关。硒能降低幼芽和幼根中的镉含量，表现为硒与镉拮抗作用，对于种子萌发各生理指标表现为抑制作用，可能是硒浓度较高，硒已失去对水稻种子萌发的促进作用。铁梅等［34］研究表明适量的硒可以有效降低萝卜镉含量，在某浓度范围内硒与镉的拮抗作用表现明显。在镉胁迫下同时添加锌硒可以有效降低经镉处理的胚根镉累积量。说明适宜锌硒浓度组合可以有效缓解镉在种子萌芽短期的累积，表现为锌硒与镉拮抗作用。镉累积量与种子发芽势、发芽率不一致，可能是由于锌硒处理可以打破种子休眠，不影响种子萌发，但镉累积会抑制胚芽胚根对养分的摄取，可能在后续的生长中显现出来，具体的镉累积机制还需要进一步的研究。

3.2 锌硒对镉胁迫水稻生长发育及各部位吸收镉含量的影响

本研究中，与对照相比，镉胁迫可导致水稻幼苗的根长、株高、叶片相对含水量、SPAD值显著降低，这与 Hasanuzzaman 等［35］、Singh 等［36］研究结果相似，可能是镉诱导下增加了水稻的氧化应激、细胞活力丧失、电解质渗漏的形成，破坏了抗氧化酶系统，降低与组成叶绿素分子、PSII氧化侧电子传递链相关的Mg、Mn、Cu含量，导致叶绿素含量降低，从而影响植株生长和光合作用［37-38］。与镉处理相比，镉胁迫下添加不同浓度锌、硒，水稻幼苗的根长、株高、叶片相对含水量、SPAD值均显著增加，这与李颖［28］和王波等［39］研究结果一致，说明添加锌、硒能缓解镉对水稻生长的毒害，提高水稻保水和抗逆能力，有效缓解镉对叶绿体中光合机制的损伤［40］。分析水稻不同处理下根、茎、叶各部位镉含量及转运系数可知，在镉胁迫下添加锌、硒及同时添加锌硒均明显降低镉在根、茎、叶中的累积，锌硒对水稻根系镉含量降低效果较好；硒、锌硒均显著减少镉向茎、叶的转运，其中硒的效果较好。综合分析可知，锌可明显缓解镉对根系生长的抑制作用，显著降低根系对镉的吸收。可能是锌与镉离子半径相似，锌镉竞争离子通道，产生拮抗作用，从而降低根系对镉的吸收，减少根系膜系统的氧化损伤［13，41-42］；硒可明显缓解镉对地上部分生长的抑制作用，显著降低根、茎、叶中镉含量，且显著减少镉向茎、叶的转运，这与Zhao等［43］的结论一致，可能是硒通过影响水稻根表铁膜的形成间接影响镉吸收，降低水稻根系镉含量，硒对镉的缓解机制可能与抑制镉从根向茎、叶的吸收与转运或硒与镉在植物中产生螯合物有关［44］，且对提高光合色素含量起促进作用［29］；当添加锌硒时，与镉处理相比，使水稻株高、SPAD值显著降低，加重了毒害作用，但显著降低根系镉含量及根向地上部分的转运，所以锌硒镉联用并不能缓解镉对水稻生长的抑制作用，锌硒与镉的拮抗作用使根系镉含量及向地上部分的转运减少，但所加入的锌硒可能会产生重金属过量，导致根长、株高、相对含水量、SPAD值降低，进而影响水稻生长发育和光合作用，目前锌硒镉对水稻生长发育的作用机制还需进一步的研究。