硫酸黏菌素及其制剂的检测方法验证及优化

2022-06-08张美玉谢彦军曹永慧

中国新技术新产品 2022年4期

张美玉谢彦军曹永慧

（山东鲁抗舍里乐药业有限公司高新区分公司，山东济宁 272000）

硫酸黏菌素又名硫酸黏杆菌素，克里斯汀（Colistin Sulfate）、多黏菌素（PolymyxinE）、抗敌素等，它是1950 年由日本的小山抗浮从福岛县土壤中分离到的1 株多黏芽孢杆菌抗敌素变株的培养液中提取的一种锁环状多肽类抗生素，为白色粉末，易溶于水，耐热，消化道不易吸收，排泄迅速，毒性小，无副作用，不易产生耐药菌株，是最安全的抗生素之一，几乎对所有的革兰氏阴性菌有效，对绿脓杆菌有显著作用。治疗时常与抗革兰氏阳性菌的杆菌肽锌合用。其含量测定《中国兽药典》2020 版规定为生物效价测定方法，但其方法具有操作步骤复杂、检验周期长、影响因素多等缺点，随着兽药的发展和检验制度的完善，为了满足生产的需要，提高检验效率及检验准确度，该文采用高效液相色谱法检测原理，建立快速、准确的HPLC 测定兽药硫酸黏菌素的含量检测方法。

1 主要仪器与试剂

Agilent 1260 Infinity II，硫酸黏菌素标准品（中国兽医药品监察所），乙腈（色谱纯），无水硫酸钠（分析纯），其余试剂为分析纯，硫酸黏菌素原料。10%硫酸黏菌素可溶性粉，10%硫酸黏菌素预混剂均为山东鲁抗舍里乐药业有限公司高新区分公司生产（均已用生物效价法测定含量）。

2 结果分析

2.1 测定方法

C18 键合硅胶色谱柱，检测波长215nm，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量20uL，流动相0.1mol/L 无水硫酸钠溶液∶乙腈=4 ∶2，用磷酸调酸碱度至pH 为2.4 左右。

溶液的制备对照品溶液：精密称定标准品25mg，置50mL 的容量瓶中，加流动相稀释至相应刻度，摇匀，制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL 的对照品溶液。供试品溶液：精密称定硫酸黏菌素可溶性粉250mg，置50ml 的容量瓶中，加流动相稀释至相应刻度，摇匀，制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL的硫酸黏菌素可溶性粉溶液。

精密称定硫酸黏菌素预混剂250mg，置50mL 的容量瓶中，加流动相适量超声助溶5min，冷却，定容至刻度，制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL 的硫酸黏菌素预混剂溶液。

系统适用性溶液：取硫酸黏菌素对照品溶液，精密量取对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，相邻峰间的分离度应大于1.5，各峰的拖尾因子不得大于1.5。

系统适用性结果：相邻峰间的分离度均大于1.5，各峰的拖尾因子小于1.5，见表1。

表1 系统适用性试验

2.2 分析方法优化

通过对流动相、波长、溶剂、进样量等条件进行选择，确定最佳试验条件。

为了考察乙腈对检测结果的影响，分别选择流动相为无水硫酸钠溶液、无水硫酸钠溶液∶乙腈=40 ∶20、无水硫酸钠溶液∶乙腈=45 ∶15，无水硫酸钠溶液均为0.1 mol/L，结果表明，当无水硫酸钠溶液∶乙腈=40 ∶20 时，色谱图中各峰的峰形较好，分离度良好；为了考察无水硫酸钠溶液浓度的影响，固定乙腈的比例，分别比较当磷酸盐浓度为0.1mol/L 和0.2 mol/L 的检测结果，发现0.1mol/L 的无水硫酸钠溶液时，峰形对称性好且流动相中含盐浓度低，对色谱柱寿命影响相对较小，更符合方法学要求。

采用紫外可见光检测器，对硫酸黏菌素对照品、原料及其制剂溶液在200nm～400nm 波长内进行扫描，评价硫酸黏菌素的紫外吸收行为。测得在215nm 处均有较明显吸收，故选择215 nm 为测定波长是合理的。

硫酸黏菌素原料，易溶于水，分别采用水和流动相作为空白溶剂，比较硫酸黏菌素制剂的色谱行为。试验表明，以水做空白溶剂时，可溶性粉溶解性良好而硫酸黏菌素预混剂溶解性很差，而且出现倒峰，选流动相作为溶剂，不会出现倒峰，对预混剂来说，由于辅料及工艺原因导致溶解性稍差，必须经过5min 超声处理才能溶解，综合分析选用流动相作为溶剂。

2.3 方法学考察

精密称取原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素预混剂适量进行方法适用性试验，各样品含硫酸黏菌素在一个水平，各精密称定6 份样品，每份样品各进2 针，取其峰面积平均值，图1～图4 表明对照品、原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素预混剂色谱图中均含有这5 种主要物质，而且这5 种物质在不同时间出峰，分别命名为1～5。硫酸黏菌素原料及制剂中这5 种物质出峰时间和硫酸黏菌素标准品出峰时间保持一致，色谱图峰形很好。而且拖尾因子均小于1.5，说明所测物质相同，各峰分离度良好，达到完全分离，根据峰面积计算含量结果与《中国兽药典》2020 版生物等效法测定值一致，见表2 和表3，说明结果稳定可靠，影响因素少。

表2 生物效价法测定结果

表3 高效液相色谱法测定结果

图1 硫酸黏菌素标准品色谱图

图2 硫酸黏菌素原料色谱图

图3 10%硫酸黏菌素可溶性粉色谱图

图4 10%硫酸黏菌素预混剂色谱图

精密称取对照品适量，置合适的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配制成0.5mol/L 的硫酸黏菌素标准品溶液，将其标准品溶液连续进样6 针，记录峰面积值，并计算相对标准偏差。

结果表明相对标准偏差为0.3%，说明精密度良好，数据可靠，仪器状态良好。

配制标准浓度为2.0mg/mL 的标准溶液，精密量取1mL、2mL、3mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL 置10mL 容量瓶中，配制成浓度为0.2mg/mL～1.8mg/mL 的标准溶液。各取20uL 进样，记录色谱图，横坐标为样品浓度，纵坐标为样品峰面积做线性回归，浓度在0.3mg/mL～1.6mg/mL 和峰面积呈线性相关，线性回归方程为=2568425.6（=0.9999）。表明样品检测浓度为0.5mg/mL 在线性范围内。

分别取原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素预混剂适量和可溶性粉混合配制成样品浓度为0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL 的溶液，每个浓度做两次重复并计算平均回收率。结果表明，当样品浓度在0.5mg/mL 时，回收率高于98.0%，说明试验结果稳定可靠，方法正确，准确度高，见表4。