在线固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆质谱快速测定地表水中磺胺类抗生素

许燕娟，沈斐,2*，魏焕平，魏竹秋，章嘉晴

(1.江苏省无锡环境监测中心，江苏 无锡 214121； 2.江南大学环境与土木工程学院，江苏 无锡 214122)

磺胺类抗生素是最早人工合成、使用量最大的抗生素之一，具有抗菌谱广、性质稳定、价格低廉等优点，被广泛应用于人工养殖和临床治疗。磺胺类抗生素在人体及动物体内不能被完全吸收，大部分会随着排泄物排出体外，进入环境，进而对自然水体造成污染。近年来，抗生素在国内水环境中检出的报道屡见不鲜[1-3]。水环境中的抗生素浓度较低，普遍处于痕量及微量水平，预处理通常使用固相萃取法[4]、固相微萃取法[5-6]和液液萃取法[7]纯化和浓缩目标物，从而满足对痕量抗生素的分析需求。但是传统的前处理方法需要进行人工萃取，工作量较大，操作及分析测试时间较长。在线固相萃取-液相色谱质谱联用技术具有快速灵敏、定量准确、检出种类多等优势[8]，是目前国际上最先进的痕量有机污染物快速分析方法之一。现通过优化全自动在线固相萃取、液相色谱和三重四极杆质谱三者的实验条件，建立了快速定性、定量分析地表水中磺胺类抗生素的方法，对完善饮用水源地监测预警体系，正确评估水体抗生素污染程度具有重要价值，为环境管理提供重要的技术支持和数据支撑。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

1.1.1 仪器

在线固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用系统：2777C全自动在线前处理系统(美国Waters公司)；AQUITY UPLCTM超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；API4000+三重四极杆质谱仪(美国AB Sciex公司)；Acquity BEH 130 C18色谱柱(2.1 mm ×100 mm×1.7 μm，美国Waters公司)；Acquity BEH C18色谱柱(2.1 mm ×100 mm×1.7 μm，美国Waters公司)。Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司)；HLB Direct Connect HP 在线固相萃取柱(2.1 mm × 30 mm × 20 μm，美国Waters公司)；0.22 μm聚四氟乙烯滤膜(美国Waters公司)。

1.1.2 试剂

甲醇、乙腈和正己烷(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(98%，美国Sigma-Aldrich公司)；磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺甲氧嗪(SMP)、磺胺甲恶唑(SMX)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD)、磺胺间甲氧嘧啶(SFZ)、磺胺异恶唑(SIZ)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺间二甲氧嘧啶(SMM)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SDM’)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺苯吡唑(SPP)和磺胺喹恶啉(SQX) (1 000 mg/L，北京坛墨质检科技有限公司)。

1.2 样品采集及前处理

样品采集：采用50 mL棕色磨口玻璃瓶采集样品，预先加入100～150 μL甲醇防止微生物生长。水样应充满采样瓶，在避光4 ℃保温箱中保存。水样采集后，12 h内送至实验室。

样品前处理：取10 mL样品，经0.22 μm的聚四氟乙烯滤膜过滤，如果水样颗粒物较多，可以先6 000 rmp离心10 min，取上清液后再用滤膜过滤的方式将颗粒物去除。加入甲酸调节pH值至2～3，放入样品瓶中待测。

1.3 实验条件

1.3.1 在线固相萃取条件

流动相A为含1%甲酸的超纯水溶液，流动相B为含1%甲酸的甲醇，流动相C为甲醇/丙酮/正己烷(体积比为1∶1∶1)。实验进样量为5.0 mL。在线固相萃取条件参数见表1。流动相比例变化在分段结束时步进至最终条件。

表1 在线固相萃取条件参数

1.3.2 超高效液相色谱条件

流动相A1为含0.1%甲酸的超纯水溶液，流动相B1为乙腈溶液。色谱柱柱温为40 ℃。超高效液相色谱流动相梯度洗脱程序见表2。

表2 超高效液相色谱流动相梯度洗脱程序

1.3.3 三重四极杆质谱条件

采用多反应监测(MRM)模式，使用电喷雾电离源(ESI+源)分析，喷雾电压为5 500 V，气帘气压为2.07×105Pa，雾化温度为550 ℃，雾化气压为3.79×105Pa，辅助气压为4.14×105Pa。特征离子经过对锥孔电压和碰撞电压等因素的优化，确定了质谱分析参数(表3)。

表3 质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 在线固相萃取柱选择

HLB固相萃取柱由特殊的共聚合技术制备而成，含有疏水性的二乙烯基苯结构和亲水性的N-乙烯基吡咯烷酮结构，是酸性、碱性、中性化合物的通用型固相萃取柱，具有良好的吸附萃取效果，相对于C18填料固相萃取柱具有更强的适用性，在抗生素分析中被广泛使用[9]。因此，本方法采用HLB Direct Connect HP 作为在线固相萃取柱。

2.2 样品pH值对在线固相萃取效率的影响

由于抗生素含有酸性或碱性官能团，因此样品的pH值决定了它们的电离状态，从而影响其萃取效率[10]。当样品的pH值高于待测物的pH值时，待测物分子以亲水离子存在，无法在疏水基团的固相萃取小柱上保留。水样的pH值很大程度地影响了目标物在水样中的存在形态、稳定性以及固相萃取柱对目标物的富集效果，因此将pH值调节为2～7，再进行回收率对比实验。基于液质检测的原理，建议使用甲酸、乙酸或者三氟乙酸(正离子)来调节样品的pH值，本研究采用甲酸调节pH值，样品pH值对回收率的影响见图2。由图2可见，pH值为中性时，回收率较差；pH值为2～3时，回收率有明显提升，在线固相萃取效果较好。

图2 样品pH值对回收率的影响

2.3 淋洗液的选择

复杂基质样品在分析过程中，基质成分与待测物在雾滴表面离子化竞争过程中会显著地降低或增强目标离子的生成效率及离子强度，进而对测定结果产生严重影响。目前关于基质效应的研究在国内外已有较多成果发表[8,11-12]，但水环境中抗生素相关成果较少，在复杂基质中的抗生素分析更是鲜有报道。在基质较为复杂的实际样品加标实验中发现，在线固相萃取小柱未经淋洗液淋洗，部分化合物受基质效应影响，响应值明显偏低，导致回收率结果降低。不同淋洗液有机相比例对目标化合物回收率的影响见表4。由表4可见，采用含有一定比例的有机相水溶液淋洗，能够降低基质效应的影响，提高加标回收率;采用过高比例的有机相水溶液淋洗，则会将目标物洗脱下来，导致回收率下降。因此，选择最佳淋洗液有机相比例为1%～5%的甲醇水溶液。

表4 不同淋洗液有机相比例对目标化合物回收率的影响

2.4 色谱柱对色谱峰形和分离的影响

本研究选用常见的Acquity BEH 130 C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)、Acquity BEH C18(2.1 mm×50 mm×1.7 μm) 和 Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm) 色谱柱，通过注射磺胺类抗生素标准品，研究超高效液相色谱柱上的分离效果。3种色谱柱分离磺胺类抗生素的效果具有一定差异，采用Acquity BEH C18(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)时，磺胺类抗生素色谱峰形较宽，分离度也不理想。这可能是因为色谱柱较短，理论塔板数无法满足多个磺胺类抗生素的测定。而Acquity BEH 130 C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)和Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)由于色谱柱较长，理论塔板数较前者更高，分离效果和色谱峰形要好于50 mm短柱。特别是Acquity BEH 130 C18色谱柱，由于该色谱柱为肽分析柱，在分析含有大量藻类的富营养化地表水样品时具有较好的分析效果(图3)，因此,选择Acquity BEH 130 C18色谱柱为地表水中磺胺类抗生素的分离色谱柱。

图3 富营养化地表水样品分析效果

2.5 标准曲线、相关系数与方法检出限

配制磺胺类抗生素混合标准溶液，以目标组分的响应值y对相应的质量浓度x绘制标准曲线，无法进行色谱分离的同分异构体使用响应值加和计算。在去离子水中添加低质量浓度标准溶液(1.0～5.0 ng/L)，按照上述方法进行测定，计算标准偏差S，按MDL=S×t(n-1，0.95)计算方法检出限。式中，t(n-1，0.95)为置信度为95%、自由度为(n-1)时的t值；n为重复样品数。标准曲线、相关系数和方法检出限见表5。由表5可见，浓度范围内线性良好，检出限达到ng/L级，满足了磺胺类抗生素痕量分析测试的要求。

表5 标准曲线、相关系数和方法检出限结果(n=7)

2.6 精密度和准确度

在地表水样品中添加不同质量浓度的加标溶液，按上述方法进行测定，每个质量浓度平行测定7次，计算回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表6。由表6可见，水样的加标测定值其RSD≤10.6%，回收率为80.6%～113%，能够满足日常测定的要求。

表6 精密度和准确度(n=7)

2.7 实际水样分析

按上述实验方法对无锡某地表水点位实际水样进行分析(表7)。由表7可见，部分磺胺类抗生素有检出。因此，对于地表水中抗生素污染应给予重视，确保水质和生态环境安全。

表7 实际水样测定①

3 结语

采用在线固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆质谱法快速测定地表水中磺胺类抗生素，该方法简便快捷，灵敏度高，分析时间仅需17 min，克服了传统分析方法工作量较大，前处理及分析测试时间较长，操作烦琐等缺点。空白水样的加标测定值其RSD≤10.6%，回收率为80.6%～113%，能够满足日常测定要求，适用于抗生素污染的应急突发事件的快速定性、定量测定，以及大批量抗生素污染样品的快速监测需求。