基于转录组测序筛选不同性别C57BL/6J小鼠差异基因及通路

李昱昊，李艳玲，尹雪莉，孙晓梅，张 军，李名聪,2，刘 莉,3，张素梅，张胜权

学习记忆是多个脑功能区共同协调完成的高级脑电活动，也是神经科学研究的热点之一。目前研究最清楚的解剖部位是海马体，它位于哺乳类动物颞叶深部外侧，海马齿状回(DG)-CA1-CA3神经环路是记忆形成的关键解剖区域[1-2]。不同性别的C57BL/6J小鼠行为学存在差异，在焦虑样行为测试中，同年龄的雄性小鼠比雌性小鼠表现出更强的抗焦虑行为；在空间学习记忆测试中，如Morris水迷宫实验，同等条件下，雄性小鼠比雌性小鼠能更快地完成学习任务，这种效应与年龄无关[3-4]。因此，在行为学实验中，通过转录组测序技术筛选出不同性别差异基因并寻找差异信号通路进行比较，能够为后续相应行为学测试优化实验方法和进行针对性研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 实验动物8周龄的C57BL/6J小鼠购自安徽医科大学实验动物中心，所有的动物实验均通过安徽医科大学动物伦理委员会的批准。

1.2 主要试剂10 ml 4%的戊巴比妥钠由安徽省立医院麻醉科提供；引物购自生工生物上海有限公司；总RNA提取试剂盒与逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)染料购自美国Thermo Fisher公司。

1.3 主要仪器RT-qPCR分析仪购自瑞士Roche公司；脱色摇床购自上海沪析科技有限公司；恒温水浴锅购自上海冠森科技有限公司。

1.4 海马总RNA提取及cDNA文库的构建不同性别的8周龄的C57BL/6J小鼠各被分为2组(每组各3只)。使用4%的戊巴比妥钠麻醉小鼠，心脏抽血后处死，迅速完整取出小鼠海马体，使用液氮将组织研磨成粉末，然后借助试剂盒完成总RNA提取并按说明书完成mRNA的纯化。随后借助逆转录试剂盒完成cDNA文库的构建。

1.5 有参转录组测序委托深圳华大基因科技有限公司对所得cDNA文库进行测序。

1.6 RT-qPCR分析从小鼠海马组织中提取总RNA，按照试剂盒说明书步骤进行操作。将提取的总RNA和特定引物作为逆转录原料，并使用逆转录试剂盒构建cDNA文库。使用10 μl SYBR Green荧光染料、400 ng cDNA和0.4 mmol的特定引物，用超纯水定容到体积为20 μl的混合体系。使用RT-qPCR仪进行RT-qPCR分析。该PCR步骤为：95 ℃预变性30 s，然后在90 ℃、20 s的条件下进行40个循环的扩增，随后95 ℃变性5 s，在72 ℃退火15 s，最后在95 ℃延伸5 s及60 ℃、1 min的条件下分析熔解曲线。每个反应重复进行3次，使用2-ΔCt方法分析RT-qPCR结果，然后使用β-肌动蛋白(β-actin)作为标准对照对所得数据进行统计分析。

1.7 差异基因筛选与相互作用使用GO和KEGG数据库分析不同性别小鼠海马体转录组中显著上调与下调的基因，Q≤0.05为存在统计学意义的阈值。HISAT(Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts)是一款用于RNA-seq read比对参考基因组的软件(http://www.ccb.jhu.edu/software/hisat)。它采用全基因组和局部基因组两种索引形式，能迅速地筛选出基于设定条件下的差异基因。Cytoscape是将所得差异基因数据转化成网络相互作用图的一个软件，可以准确分析指定基因或基因组的相关性。每个节点代表一个基因，连线代表基因间相互作用，关键基因用红色节点(KDA)标出,蓝色节点表示初始基因。将测序所得的数据库结果导入Cytoscape 软件进行分析并挖掘联系最为紧密的基因。

1.8 统计学处理使用SOAPnuke软件过滤原始数据。使用Bowtie2软件将筛选过的数据与参考编码基因组对齐，然后通过RSEM软件计算基因的表达水平。结合R语言中的phyper函数进行富集分析，计算P值，然后对P值进行矫正得到Q值，通过Bonferroni校正方法在Q≤0.05的条件下分析基因的差异表达情况。并基于超几何测试方法对带注释的不同基因表达情况进行了分析。对RT-qPCR数据,使用Graphpad Prism 8.0统计软件进行分析处理，全部实验数据以2-ΔCt表示，实验组与对照组采用两独立样本t检验进行结果分析，方差不齐者采用校正t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达基因将处理后的原始数据进行筛选后显示，与雄性组相比，雌性组小鼠共有325个差异基因，其中上调基因233个，下调基因92个。见图1。

图1 不同性别C57BL/6J小鼠差异基因柱状统计图a:高表达基因；b:低表达基因；与雄性组比较：**P<0.01

2.2 差异基因GO分析和KEGG分析通过GO数据库筛选，按照从大到小的顺序进行排列，分别从细胞功能(cell function)、细胞标志(cell marker)、生物功能(biological progress)、疾病相关性(KEGG disease)这几个方面对差异基因进行分析并绘制表格；结果显示，差异基因主要富集在离子通道形成、蛋白质结合、突触与细胞膜稳态、神经递质传递、细胞黏附、神经递质传递、I-型胶原组成等生物学过程。见表1。基于KEGG数据库绘制了不同性别组的差异基因富集气泡图，结果显示，差异基因较为明显的富集通路为尼古丁成瘾、长时程增强、前额叶皮质突触形成、谷氨酸能突触形成、GABA氨基丁酸突触形成、多巴胺突触形成等过程。见图2。

图2 不同性别组差异基因参与的KEGG信号通路聚类热图红色：高表达基因；蓝色：低表达基因

表1 相关基因GO数据库功能分析

2.3 差异基因相互作用网络通过HISAT数据库筛选出不同性别的小鼠海马体中的差异基因，使用Cytoscape软件算出每个基因的连接程度(degree)，结果显示共有362个连接点和1 703个相互作用边,见图3。连接程度表示差异基因网络中每个基因与周围基因的关联程度；连接程度越大，表示某一目的基因与之相关联的基因数量就越多。因此，通过对比得出雌性组与雄性组排名前10的关键基因，分别为赖氨酸脱甲基酶5D(Kdm5d，degree=135)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdkl5，degree=89)、细胞输出介质(Cle1，degree=189)、多巴胺受体6a3(Slc6a3，degree=201)、盒式转录因子(Fox，degree=143)、前体mRNA加工因子4B(Prpf4b，degree=189)、甘氨酸受体4(Glur4，degree=243)、钙离子受体2(Camk2，degree=143)、DNA和RNA结合蛋白家族(Son，degree=153)、5-羟色胺受体5b(Htr5b，degree=164)，见表2和图4。

图3 不同性别的C57BL/6J小鼠海马体差异基因相互作用网络图

表2 实时荧光定量PCR目的基因的引物

图4 雌雄C57BL/6J小鼠核心基因荧光定量PCR分析结果a:kdm5d；b:Cdkl5；c:Cle1；d:Slc6a3；e:Fox；f:Prpf4b；g:Glur4；h:Camk2；i:Son；j:Htr5b；与雄性组比较：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

本研究通过对不同性别的C57BL/6J小鼠海马体进行转录组测序获得相关差异基因，并通过对差异基因进行GO富集分析和KEGG富集分析，对使用不同性别的动物进行行为学测试优化了方法，并为神经科学的研究提供了新的研究思路。

本研究在雌雄小鼠中筛选出325个差异基因，其中上调基因233个，下调基因92个。由于差异基因相对过多，因此只列举了GO富集分析中差异最为显著的52个差异基因和KEGG中的20条通路；这些生物学过程主要参与了尼古丁成瘾、长时程增强、前额叶皮质突触形成、谷氨酸能突触形成、GABA氨基丁酸突触形成、多巴胺突触形成等过程；在分子功能上这些差异基因主要增强了神经递质传递、突触后电位等过程，减弱了细胞间连接、神经递质活性、钙离子信号通路和蛋白质折叠、神经元连接等过程；测序的结果还表明，这些差异基因减弱了细胞周期调控、外泌体分泌等过程，但确切的机制还需要进一步探索。

通过测序对上述基因进行分析，有3种编码神经递质受体相关基因与神经系统疾病密切相关。首先是Slc6a3，它与多巴胺转运密切相关；多巴胺是大脑中一种儿茶酚胺类神经递质，参与调节大脑信息传递速度，提高神经元和神经胶质细胞兴奋性和高级哺乳动物情感活动；研究[4-5]表明，多巴胺减少不仅与帕金森综合征有关，还与阿尔兹海默病的发生发展密切相关。其次是Htr5b，5-羟色胺参与大脑接收、加工、整合外界信息过程[6-7]。最后是Glur2，该受体主要调控神经元谷氨酸门控离子渗透型通道，能改变通道传导性，尤其是电压门控的钙离子通道，该通道参与神经系统的损伤与修复过程[8-10]。

近年来，随着测序技术的发展，对于学习记忆的研究逐渐深入到基因水平[11-15]，但确切的分子机制及神经元调控网络仍然不明确；通过转录组测序找出差异基因和相关信号通路，目的在于寻找不同性别的动物大脑中与学习记忆有关的差异基因及通路。本研究得到的10个关键基因Kdm5d、Cdkl5、Cle1、Slc6a3、Fox、Prpf4b、Glur4、Camk2、Son、Htr5b或许可以成为新药开发的位点，但由于神经系统的复杂性，在神经生物学研究的过程中如何将这些基因与疾病进行联系，仍然需要进一步实验探索。