视黄酸通过TLR4/NF-κB 通路对脂多糖诱导血管炎症与氧化应激的影响

李琛，张英杰，孙洋，王洪新

1.锦州医科大学附属第一医院心内科，辽宁 锦州 121001；2.锦州医科大学心脑血管药物研究重点实验室，辽宁 锦州 121001

在多种血管疾病中观察到不同程度的血管炎症和氧化应激，包括动脉粥样硬化，高血压和血管老化[1～3]。通常，血管炎症和氧化应激与内皮功能障碍和血管损伤密切相关。二者在心血管疾病中的作用已经得到了广泛的研究。炎症是由血管损伤引起的一个有序过程，它能增强白细胞的粘附性和趋化性，最终引起原位激活。这一过程由细胞因子的局部分泌协调，这些细胞因子的表达是由血管损伤诱导的信号转导网络引起的[4]。氧化应激反映出氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡，朝着有利于氧化剂的方向发展[5]。Toll 样受体（TLRs）能够识别病原体相关分子模式（PAMPs）的微生物结构成分。在识别PAMPs 时，TLRs 触发促炎介质的产生[6]。TLRs 也参与了氧化应激的发生[7]。

RA 作为维生素A 的活性衍生物,具有多种免疫调节作用，广泛参与了各种生理进程的调节[8]。同时，RA 具有多种生理功能，包括抗炎[9]和抗氧化[10]。大量研究表明，RA 具有抗炎和抗氧化的作用，但其具体作用机制尚不清楚。因此，本实验进一步探讨RA对血管炎症和氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 实验对象、实验药品和试剂

健康雄性SD 大鼠40 只，5～6 周龄，体重(200±10)g，由锦州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(辽）2014-0004。

视黄酸（纯度≥98%，美国Sigma 公司）；视黄酸（RA）乙酰胆碱（Ach）和脂多糖（LPS）（美国Sigma 公司）；TLR4 抑制剂（美国Abmole 公司）；p-eNOS、TLR4 和NF-κB p65 抗体（美国ABclonal 公司）；IL-18、IL-1β、TNF-α、IL-6 和GSH-px ELISA 试剂盒（上海Mlbio 生物科技有限公司）；一氧化氮测定试剂盒、总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒和丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物技术有限公司）；DHE 荧光探针（碧云天生物技术有限公司）；eNOS 和β-actin抗体（美国Proteintech 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 健康雄性SD 大鼠40 只，置于适宜的环境中[(25±2)℃，12 h 光暗循环]，适应性喂养7 d后，将大鼠随机分为5 组（n=8）：对照组、LPS 组、RA 3 mg/kg 组、RA 15 mg/kg 组和TLR4 抑制剂组（3 mg/kg）。大鼠经RA 和TLR4 抑制剂连续灌胃治疗2 周后，除空白组外，其余大鼠通过腹腔注射LPS (10 mg/kg)以建立急性血管炎症模型。8 h 后收集血清与主动脉，用于血管张力、免疫组化、ELISA 和免疫印迹等实验。

1.2.2 体内离体血管环实验 SD 大鼠经20%乌拉坦麻醉后，取出胸主动脉，并置于冰冷的PSS 溶液中(mM):NaCl (130);KH2PO4(1.18);KCl (4.7);NaHCO3(14.9);CaCl2(1.16);EDTA(0.026);MgSO4·7H2O(1.17)，然后小心剔除血管表面的脂肪组织和结缔组织。将长度为1～2 mm 的胸主动脉环悬挂于张力换能器上。在无任何外力的作用下，仪器张力调零。血管环在15 mN 的张力下稳定1h。时间结束后，在浴槽中加入60 mmol/L KCl 诱发胸动脉环收缩，PSS 溶液清洗3次。然后10-6mmol/L 的PE 预收缩胸动脉环，待张力达到平衡稳定时，累积添加梯度浓度的Ach (10-9～10-5mol/L)，观察并记录胸动脉环张力的变化情况。PE 诱发胸动脉环的最大血管收缩幅度与初始血管张力之间的差值，作为胸主动脉的最终收缩幅度，在加入梯度的Ach 后张力的变化幅度与最终加入相应剂量Ach 的收缩幅度之比，反应张力的变化。

1.2.3 ELISA 法 按照ELISA 试剂盒说明书，测定血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、IL-6 和GSH-px 的水平。

1.2.4 免疫组化法 石蜡切片在60℃烘箱中放置60 min 后进行脱蜡脱水。然后将处理完的切片置于含有抗原修复液的高压锅内，121℃抗原修复3 min。切片冷却至室温后，PBS 清洗3 次，使用3% H2O2室温孵育15 min。然后血清封闭10 min，滴加一抗NF-κB p65（1：100），在4℃中孵育过夜。PBS 清洗切片3 次，滴加二抗，室温孵育30 min。PBS 清洗3 次，滴加有辣根过氧化物酶的切片，在37℃水浴锅孵育30 min。DAB显色，苏木素5min。最后经酒精脱水，二甲苯透明后，封片观察。采用LEIKA 显微镜进行拍摄，LAS V4.3软件分析NF-κB p65的阳性率，核棕色即为阳性。

1.2.5 Western blotting 冻存的新鲜组织从冰箱中取出后，将剪碎的20 mg 组织置于100 μl 的裂解液（RIPA+1% PMSF）中裂解30 min。蛋白浓度通过BCA 法进行蛋白定量。制备10%的分离胶和5%浓缩胶，在90V 的电压下，运行2 h。通过半干转法将蛋白转移至PVDF 膜上。5% BSA 常温封闭2 h。PVDF膜在含有TLR4（1:1000）、eNOS（1:1000）、p-eNOS（1:1000）和β-actin（1:1000）一抗的孵育盒中4℃孵育过夜。TBST 清洗3 次，每次5 min。PVDF 膜在辣根过氧化物酶标记的二抗（1：5000）溶液中，常温孵育1.5 h，ECL 发光显影。

1.2.6 DHE 荧光 将浓度为2 μmol/L DHE 荧光探针滴加在冰冻切片上，在37℃孵育15 min，DAPI 染色5 min。PBS 在暗处清洗3 次，每次5 min。然后在荧光显微镜下进行拍摄。相对荧光强度通过Image J 软件进行分析。

1.2.7 NO、SOD 和MDA 的测定 大鼠血清中的NO、SOD 和MDA 分别通过硝酸还原酶法、WST-1 法和TBA 法进行测定，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析

采用SPSS25.0 统计软件进行数据分析，数据均以表示。多组间显著性检验采用单因素方差分析和LSD 法。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RA 对体内血管舒张功能的影响

在本实验，与对照组相比，LPS 组血管舒张功能显著的降低。经RA 和TLR4 抑制剂治疗后，LPS 组血管的舒张功能得到显著的改善（见表1）。

表1 RA 对大鼠血管舒张功能的影响（,n=4,mN）Tab.1 Effects of RA on vasodilation function in rats (Mean±SD, n=4,mN)

表1 RA 对大鼠血管舒张功能的影响（,n=4,mN）Tab.1 Effects of RA on vasodilation function in rats (Mean±SD, n=4,mN)

与LPS 组比较*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 RA对血管eNOS、p-eNOS和血清NO水平的影响

与对照组相比，LPS 组血管p-eNOS 的表达和NO水平显著的降低，而经过RA 和TLR4 抑制剂治疗之后，p-eNOS的表达和NO水平显著升高（见图1、表2）。

表2 RA 对血管p-eNOS、eNOS 蛋白和NO 水平的影响（, n=3）Tab.2 Effects of RA on the levels of p-eNOS,eNOS protein and NO in blood vessels (Mean±SD, n=3)

表2 RA 对血管p-eNOS、eNOS 蛋白和NO 水平的影响（, n=3）Tab.2 Effects of RA on the levels of p-eNOS,eNOS protein and NO in blood vessels (Mean±SD, n=3)

与LPS 组比较*P＜0.05，**P＜0.01

2.3 RA 对血清IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 的影响

对照组大鼠经LPS 处理后，LPS 组大鼠血清炎症因子IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 显著升高，而RA 组相关炎症因子显著的降低，并且呈浓度依赖性，其中RA 剂量为15 mg/kg 的治疗效果最佳。同时，LPS 组经过TLR4 抑制剂处理后，炎症因子IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 也显著的降低（见表3）。

表3 大鼠血清IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 含量的变化（, n=8）Tab.3 Changes of serum levels of IL-18,IL-1 β,TNF-α and IL-6 in rats (Mean±SD, n=8)

表3 大鼠血清IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 含量的变化（, n=8）Tab.3 Changes of serum levels of IL-18,IL-1 β,TNF-α and IL-6 in rats (Mean±SD, n=8)

与LPS 组比较*P＜0.05，**P＜0.01

2.4 RA 对氧化应激指标ROS、SOD、MAD 和GSH-px的影响

与对照组相比，LPS 组MDA 和ROS 显著升高，而SOD 的生成和GSH-px 释放量显著降低。经过RA和TLR4 抑制剂治疗后，以上的变化得到逆转（见图2、表4）。

表4 RA 对ROS、SOD、MAD 和GSH-px 含量的影响（，n=6）Tab.4 Effects of RA on the contents of ROS,SOD,MAD and GSH-px (Mean±SD, n=6)

表4 RA 对ROS、SOD、MAD 和GSH-px 含量的影响（，n=6）Tab.4 Effects of RA on the contents of ROS,SOD,MAD and GSH-px (Mean±SD, n=6)

与LPS 组比较*P＜0.05，**P＜0.01

2.5 RA 对血管TLR4 和NF-κB p65 蛋白表达的影响

与对照组相比，LPS 糖组TLR4 蛋白表达和核NF-κB p65 阳性表达率显著升高，而RA 组能显著的降低TLR4 和核NF-κB p65 阳性表达率，且RA 的作用与TLR4 抑制剂相似（见图3、表5）。

表5 RA 对血管TLR4 的表达和核NF-κB p65 阳性表达率的影响（, n=3）Tab.5 Effects of RA on TLR4 and NF-κB p65 expression rate(Mean±SD, n=3)

表5 RA 对血管TLR4 的表达和核NF-κB p65 阳性表达率的影响（, n=3）Tab.5 Effects of RA on TLR4 and NF-κB p65 expression rate(Mean±SD, n=3)

与LPS 组比较*P＜0.05，**P＜0.01

3 讨论

氧化应激和炎症密切相关，氧化应激可引起炎症，而炎症又影响氧化应激。二者都可以导致内皮功能障碍的细胞损伤。而内皮功能障碍又促使炎性环境的形成[4]。内皮功能障碍的特征在于血管收缩增加和对Ach 的反应性降低。内皮NO 是关键的血管扩张剂之一，其生物利用度降低可导致内皮功能障碍，而eNOS 控制着NO 的合成[11,12]。实验结果表明，RA能够改善LPS 诱导的血管内皮功能障碍，同时能够增加NO 和p-eNOS 的表达。这表明RA 可能通过增加eNOS 磷酸化，促进NO 的合成释放，最终改善血管内皮功能障碍。

血管炎症和氧化应激参与了内皮功能障碍的发生[4]。炎症是对机体损伤或感染的保护性反应。这是一个复杂的过程，炎症细胞首先识别受影响的组织，白细胞招募进入组织，清除致病因子，修复损伤部位。炎症需要细胞膜，细胞外基质和促炎介质之间的相互作用，而过度炎症可导致慢性疾病的进展，如动脉粥样硬化[2]。氧化应激和促炎过程通常被认为是相互依赖的，许多研究表明氧化应激是炎症直接刺激的结果，反之亦然[13]。在氧化应激中，通常产生过量的ROS，增加MDA，同时，抗氧化系统受损导致SOD和GSH 的降低。实验结果表明，RA 能够降低LPS 诱导升高的炎症因子IL-18、IL-1β、TNF-α 和IL-6 的水平，同时也能够降低ROS 和MDA，升高SOD 和GSHpx。这表明RA 具有抗炎和抗氧化的作用。

LPS 是革兰氏阴性细菌的成分，可以激活TLR4的表达。TLR4 激活后，一些多分子复合物触发信号级联，导致NF-κB 和MAP 激酶的早期激活，并控制促炎细胞因子如TNF-α 和IL-6 的产生[6]。NF-κB 是炎症和氧化应激共同的转录因子，NF-κB 激活后，进一步的促进炎症因子和促氧化基因的转录激活，最终导致血管功能降低[13]。实验结果表明，RA 能够降低LPS诱导升高的TLR4 和NF-κB p65 的表达。而在给予TLR4 抑制剂TAK-242 后，炎症与氧化应激显著的降低，同时，血管内皮功能障碍得到改善。

本研究结果表明，RA 对LPS 诱导的血管内皮功能障碍具有保护作用，同时RA 降低炎症因子的表达并抑制氧化应激的产生，其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB p65 信号通路有关。