β-1,6 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶2在胃癌组织中的表达及其临床意义

谭晓龙，朱君，杨涛，吴峰阶（滨州医学院附属医院 胃肠外科，山东 滨州 256603）

胃癌（gastric cancer，GC）是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和病死率分别居全球恶性肿瘤的第六位和第二位[1-2]。GC 的发生和发展是由于多种因素导致的多阶段、多基因参与的复杂过程，包括炎症、饮食等多种外部因素和基因突变等内部因素的综合作用[3-5]。近年来，GC 的化疗、放疗和免疫治疗等技术手段得到了很大的发展，但由于GC患者早期症状不明显和缺少特异性生物标志物，以及其发生和发展的机制尚不明确等，使得GC的预后较差，5年生存率不足30%[5-7]。因此，寻找影响GC发生和发展的生物标志物尤为重要。研究[8-10]结果表明，糖基化是调控细胞间和细胞内信号转导、运输、免疫反应以及肿瘤发生和发展的关键因素。β-1，6 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶[glucosaminyl (N-acetyl) transferase 2，GCNT2]是GCNT 家族中的一员，是诱导Ⅰ型血型抗原合成的关键糖基转移酶。GCNT2 在结直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、食管癌和乳腺癌等恶性肿瘤组织和细胞中异常表达，发挥着重要的作用[11-14]，GCNT2可以作为早期肿瘤的诊断标志物[15]，但其在GC 中的研究报道鲜见。本研究基于基因表达综合（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库、肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库和Kaplan-Meier Plotter 数据库的GC 数据进行综合分析，探讨GCNT2在GC组织中的表达及其预后意义，同时利用免疫浸润等生物信息学技术分析GCNT2在GC发生和发展中的作用；体外实验验证过表达GCNT2对GC细胞增殖和侵袭的影响，以期为阐明GC发生和发展机制提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 数据来源及分析方法

本研究的分析数据主要来源于TCGA、GEO、Oncomine（http://www.oncomine.org），GEPIA（http://gepia2.cancer-pku.cn/）和TIMER 等数据库[16-17]。通过GEPIA2、Oncomine 等数据库数据[18-25]分析，获得GCNT2 在GC 组织和癌旁组织中的表达差异。利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）数据库[19]，获得在不同组织学分级和淋巴结转移等临床病理特征下GC 组织中GCNT2 的表达差异。pROC 软件包[26]用于分析GCNT2 mRNA在ROC曲线下的面积，以探讨其在GC 诊断中的价值。对GSE84437 数据集中433例GC 数据进行评估后获取GCNT2 的表达水平与GC患者的总生存（OS）之间的相关性[27]。

利用MEXPRESS（https://mexpress.be/）数据库[28-29]与LinkedOmics（http://www.linkedomics.orglogin.php）数据库分别分析GCNT2表达与其启动子甲基化的相关性和GCNT2 的功能富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）[30]。使用GSEA V3.0（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp）从分子签名数据库（MSigDB）获得基因集（h.all.v6.2.entrez.gmt）和ClusterprofilerR包进行分析及结果的可视化[31-32]，以P＜0.05和错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05表示具有统计学意义。单样本基因集富集分析（singlesample dene set enrichment analysis，ssGSEA）可以将免疫细胞群表达的基因特征应用于个体肿瘤标本[33]，在R软件中利用Gsva包[34]通过ssGSEA方法[35-36]对免疫细胞的浸润水平进行量化。研究中使用的反卷积方法用于分析24种免疫细胞中GCNT2的表达水平与各免疫细胞浸润程度之间的相关性，以及GCNT2的表达水平与411个免疫相关基因之间的相关性。

1.2 组织标本、细胞系及主要试剂

收集2018 年1 月至2019 年12 月滨州医学院附属医院手术治疗的25 例GC 患者的癌及配对癌旁组织标本，所有患者术前均未进行过放疗或化疗。其中，男性18例、女性7例；年龄＜60岁11例，65岁及以上14例；高分化程度19例，发生淋巴结转移者16例。人GC细胞系SGC-7901和BGC-823细胞由滨州医学院附属医院保留并传代培养。

GCNT2过表达质粒及引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，逆转录试剂盒、转染试剂Lipofectamine 2000、Trasnwell 小室均购自美国Promega 公司，TRIzol 试剂、电化学发光试剂购自北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清（FBS）购自美国BI 公司，RPMI 1640 培养液购自美国Gibco 公司，兔抗人GCNT2、STAT3和PD-L1及鼠抗人GAPDH单克隆抗体均购自Proteintech 公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG二抗购自美国KPL公司。

1.3 细胞培养及转染

研究所用细胞系均在添加10%FBS 的RPMI 1640培养基中，于37°C、5%CO2加湿培养箱中培养。将对数生长期SGC-7901 和BGC-823 细胞接种于6 孔板中，接种密度以过夜培养后细胞汇合度为60%～70%为标准。按照Lipofectamine 2000 说明书的方法，分别将过表达GCNT2（pc-GCNT2）及其阴性对照（pc-NC）的质粒转染至SGC-7901 和BGC-823细胞。

1.4 qPCR法检测GC组织和细胞中GCNT2的表达

按照TRIzol试剂说明书方法，分别提取GC组织和细胞中总RNA。将总RNA 逆转录成cDNA，再以cDNA 为模板进行qPCR 检测。GCNT2 引物序列上游 为5'-TGTTCCTGGCTCTATGCCAAA-3'，下游为5'-TTAGCAAACAGGCTTGGTGAAT-3'；GAPDH 引物序列上游为5'-GATCGAATTAAACCTTATCGT CGT-3，下游为 5'-AGCAGCAGAACTTCCACTC GGT-3'。qPCR 反应条件：95 ℃30 s 预变性；95 ℃12 s，62 ℃30 s，72 ℃延伸40 s，共40 个循环。以每个荧光信号达到阈值时经历的循环次数作为Ct 值，以GAPDH 作为GCNT2 的内参，ΔCt=Ct(GCNT2)-Ct(GAPDH)，GCNT2的相对表达量以2-ΔΔCt表示。

1.5 克隆形成实验检测GC细胞的克隆形成能力

将转染后细胞常规消化并重悬于培养液中，调整细胞密度后分别接种于6 孔板（5×103个/孔）中，常规培养7 d。用4%多聚甲醛溶液固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，光学显微镜下计数克隆形成数（大于50 个细胞计为1 个克隆），并计算克隆形成率（克隆数/接种细胞数×100%）。

1.6 Transwell实验检测GC细胞的侵袭能力

转染后的SGC-7901 和BGC-823 细胞培养24 h后常规消化并重悬于培养液中，调整细胞密度为1×105个/mL。将细胞悬液以100 µL/孔接种预铺matrigel 胶的Transwell 小室的上室中，下室中加入750µL/孔完全培养液，在培养箱中常规培养24 h 后用4%多聚甲醛溶液固定，0.1%结晶紫染色30 min。用棉签擦去上室面残余细胞，在倒置相差显微镜下计数侵袭细胞数，以此反映细胞的侵袭能力。

1.7 WB 法检测GCNT2 过表达对GC 细胞中STAT3和PD-L1蛋白表达水平的影响

按照蛋白提取试剂盒操作流程抽提细胞总蛋白。取适量蛋白样品进行10%SDS-PAGE，并将蛋白转PVDF 膜后，在2.5%脱脂奶粉中室温封闭1.5 h，加入GCNT2（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）和PD-L1（1∶1 000）及GAPDH（1∶20 000）单克隆抗体，4 ℃过夜。TBST 洗膜3 次（5 min/次），加入HRP 标记的羊抗兔IgG（1∶10 000），室温下处理1.5 h，洗膜后滴加电化学发光剂曝光、显影，用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值。

1.8 统计学处理

qPCR法、克隆形成、Transwell和WB等实验均独立重复3 次。采用SPSS 21.0 和R 4.0 统计软件对实验数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以表示，GCNT2在GC组织及相应癌旁组织中的表达差异采用两独立样本比较t检验，且为双侧检验，以P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GCNT2 mRNA在GC组织中低表达

对TIMER 和GEPIA 数据库中的GC 数据分析，结果显示GCNT2 mRNA在GC组织中表达水平显著低于癌旁组织（P＜0.05或P＜0.01，图1A、图2A），且其表达水平与GC 患者的淋巴结转移（图2B）和组织学分级（图2C）显著相关（均P＜0.01）。进一步利用Oncomine 数据库中的多数据集进行GCNT2 mRNA表达水平分析，结果均表明，GCNT2 mRNA在GC组织中的表达水平显著低于癌旁组织（图3A～E）。同时，在本院收集的25 例GC 组织标本中验证发现，GCNT2 mRNA在GC组织中的表达水平显著低于癌旁组织（P＜0.01，图1B）。

2.2 GCNT2 mRNA表达水平与GC患者诊断和预后评价中的价值

利用pROC 软件包分析5 个数据集中GCNT2 mRNA 区分GC 患者和健康人的能力，结果（图4A～E）显示在5 个数据集中其ROC 曲线下面积（AUC）和95% 可信 区间（95%CI）分 别 为0.782（0.642～0.889）、0.931（0.858～0.972）、0.788（0.716～0.855）、0.857（0.686～0.939）和0.688（0.555～0.804），表明GCNT2 mRNA对GC患者有较好的诊断价值。进一步分析GCNT2 mRNA的表达水平与GC患者预后之间的相关性，利用GSE84437 数据集中433 例GC数据进行生存分析结果（图4F）表明，GCNT2 mRNA高表达与GC患者的OS呈显著正相关（P＜0.01）。

2.3 GC中GCNT2甲基化水平升高

利用MEXPRESS 数据库分析结果显示，在探针ID cg14112601位点上，GCNT2基因在肿瘤组织中的甲基化水平显著高于癌旁组织（P＜0.05，图5），表明GCNT2 mRNA在GC组织中表达水平降低可能是由其高甲基化所致。

2.4 GCNT2 涉及的生物学功能及参与的主要信号通路

利用LinkedOmics 数据库进行GCNT2 的功能富集分析。Spearman检验以分析GCNT2和GC组织中差异表达的基因之间的相关性（图6A；红色代表正相关基因，绿色代表负相关基因）。热图显示了与GCNT2 正相关和负相关的前50 个基因（图6B、C）。功能富集分析表明，这些与GCNT2 的基因参与的生物过程主要是参与细胞形态发生的成分、细胞间黏附、多细胞生物信号、突触传递以及tRNA 代谢过程等（图6D）。所参与的分子功能及细胞成分主要是环状核苷酸结合、细胞因子受体活性、类异戊二烯结合、核糖体的结构成分、转运复合体以及线粒体内膜等（图6E、F）。其参与的KEGG信号通路主要是药物代谢、化学致癌作用、cAMP信号通路、DNA复制、细胞周期以及氨酰基-tRNA 的生物合成等信号通路（图6G）。

为深入分析GCNT2在GC发生和发展中所发挥的作用，利用GEO 数据库中GSE62254 数据集的300 例GC 患者的数据进行GSEA 分析，结果显示，GCNT2在GC中主要通过抑制IL-6/JAK/STAT3信号通路、IL-2/STAT5 信号通路、炎症反应信号通路、α/γ干扰素响应信号通路，以及NF-κB信号通路而在GC的发生和发展中发挥重要的作用。

2.5 GCNT2 mRNA表达与GC组织免疫浸润之间的相关性

GSEA 分析结果发现，GCNT2 mRNA 主要通过抑制免疫炎症相关信号通路而在GC 的发生和发展中发挥着重要的作用。因此，利用ssGSEA免疫量化了GSE62254 数据集中300 例GC 患者基因表达谱数据。相关性分析发现，GCNT2 mRNA 的表达水平与B细胞和CD8+T细胞等多数免疫细胞的浸润程度呈显著正相关（均P＜0.01），而与Th2 细胞和Treg 细胞等免疫细胞的浸润程度呈显著负相关（均P＜0.05，图7A）。进一步分析GCNT2 mRNA的表达水平与免疫相关基因之间的相关性，结果显示GCNT2 mRNA的表达水平与112 个免疫相关基因的表达呈显著正相关（P＜0.05），与25个免疫相关基因呈显著负相关（P＜0.05，图7B）。

2.6 过表达GCNT2可显著抑制GC细胞的增殖和侵袭能力

qPCR 法检测结果显示，与pc-NC 组相比，pc-GCNT2 组SGC-7901 和BGC-823细胞中GCNT2的mRNA 表达水平显著升高（SGC-7901：5.021±0.442vs0.974±0.021，P＜0.05；BGC-823：4.141±0.661vs1.441±0.136，P＜0.01），证明细胞转染成功。

克隆形成实验结果（图8A）显示，过表达GCNT2的SGC-7901 和BGC-823 细胞的克隆形成数目均明显减少（均P＜0.01）。Transwell 实验结果（图8B）显示，过表达GCNT2 后，SGC-7901 和BGC-823 细胞的侵袭能力均显著减弱（均P＜0.01）。WB 实验结果（图8C）显示，过表达GCNT2 的细胞中STAT3 和PD-L1 的表达水平均显著降低（均P＜0.01）。实验结果表明，过表达GCNT2主要通过IL-6/JAK/STAT3信号通路抑制GC细胞的增殖和侵袭能力。

3 讨论

NAKAMURA 等[11]研究发现，GCNT2 在结直肠癌组织中显著低表达，且与结直肠癌患者的淋巴结转移显著相关，机制研究发现GCNT2 的低表达可能是由于其启动子的高甲基化所致。CHAO 等[37]研究表明，表皮生长因子诱导的上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）可以诱导GCNT2 的表达水平上调，同时显著抑制结肠癌细胞miR-199a/b-5p的表达水平，进而增强结肠癌细胞的恶性相关特征。也有研究结果[12]发现，GCNT2 在黑色素瘤细胞中的表达水平显著低于正常黑色素细胞，且其表达水平与临床进展呈负相关，GCNT2 的缺失促进黑色素瘤异种移植瘤的生长，促进克隆形成并提高细胞的增殖率，相反，GCNT2过表达显著降低黑色素瘤异种移植瘤的生长，抑制克隆形成并促进细胞凋亡。

PENG等[14]研究发现，GCNT2在食管癌组织中高表达，过表达GCNT2 显著促进食管癌细胞的迁移和侵袭，GCNT2 高表达患者的OS 率明显低于GCNT2低表达患者，GCNT2可能通过EMT进程影响食管癌的发生和发展。ZHANG等[38]研究发现，GCNT2在人和小鼠来源的高度转移性乳腺癌细胞系以及基底样乳腺肿瘤组织中显著高表达，GCNT2 的表达水平也与乳腺癌患者中的转移表型显著相关。功能研究结果表明，GCNT2的异常表达可通过EMT进程促进体外细胞迁移和侵袭及体内乳腺癌细胞的肺转移。MIKAMI 等[39]研究表明，高表达GCNT2 组前列腺癌患者的OS 率显著低于低表达GCNT2 组前列腺癌患者，且沉默GCNT2 的表达则显著抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭。同样，NONAKA等[13]研究发现，在缺氧条件下，前列腺癌细胞中GCNT2 的表达水平显著上调，影响前列腺癌的发生和发展。PEREZ 等[40]发现，GCNT2 可能是黑色素瘤潜在的诊断和治疗标志物。

本研究利用多数据集综合分析以及临床样本验证发现，GCNT2在GC组织中的表达水平显著低于癌旁组织，且其表达水平与GC患者的诊断和预后显著相关。甲基化分析发现，GC组织中的甲基化状态显著高于正常组织，说明GCNT2 在GC 组织中的低表达可能是由于其启动子区域的高甲基化所致。功能富集分析发现，GCNT2 基因参与的生物过程主要是参与细胞形态发生、细胞间黏附、多个细胞生物信号、突触传递以及tRNA 代谢过程等，所参与的分子功能及细胞成分主要是环状核苷酸结构、细胞因子受体活性、核糖体的结构成分以及转运复合体以及线粒体内膜；单基因GSEA 分析发现，GCNT2 在GC中主要通过抑制IL6/JAK/STAT3、IL-2/STAT5、炎症反应、α/γ 干扰素响应以及NF-κB 等信号通路。免疫分析发现，GCNT2 的表达水平与B 细胞和CD8+T 细胞等多数免疫细胞的浸润程度显著正相关，而与Th2细胞和Treg 细胞等免疫细胞的浸润程度显著负相关，且其表达水平与多数免疫相关基因的表达呈显著正相关，而与少量免疫相关基因呈负相关，且过表达GCNT2 后STAT3 和PD-L1 的表达水平显著下降。本研究结果说明，GCNT2的在GC组织中的低表达可能是由于启动子区域的高甲基化所致，而高表达GCNT2主要通过抑制IL6/JAK/STAT3信号通路和免疫相关致癌信号通路以及促进B细胞和CD8+T细胞等免疫细胞的活性而在GC 的发生和发展中发挥着重要的作用，提示GCNT2 可能是GC 细胞进行免疫治疗的新靶点。

综上所述，GCNT2在GC中可以作为GC诊断和预后的标志物。GCNT2在GC中主要发挥抑癌作用，可能是由于激活免疫细胞而发挥抑癌作用。基于本研究主要基因数据库挖掘以及生物信息学分析结果，课题组将进行体内体外实验，分析验证GCNT2在GC 免疫微环境中的作用，以期为GC 的诊疗提供新的思路。