NLRP3炎性小体在辐射诱导肝损伤中的作用

丁艳平，张培怡，董晓庆，李昕妍，马一凡

(西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730070)

电离辐射(Ionizing radiation， IR)在医学上常用于肿瘤和癌的放射治疗[1]，其对人体损伤程度可因辐射剂量及机体辐射敏感度而异．对正常组织辐射毒性机制的评价表明，炎症在早期和晚期IR的不良反应中起着重要作用．近年来，有研究表明，核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体的表达上调在辐射损伤中起关键作用[2]．NLRP3炎症小体作为激活Caspase-1的多蛋白复合物，可导致白介素-18(IL-18)和白介素-1β(IL-1β)等促炎细胞因子成熟[3]．研究表明，NLRP3炎症小体的上调对辐射损伤有很大影响，其中包括辐射引起的口腔粘膜炎[4-5]、皮肤反应[6]、肺损伤[7-8]、肠道损伤[9]．前期的实验表明，辐射会对肾[10]和肺[11]的功能及组织学水平、细胞学水平造成不同影响，但是辐射对肝脏的损伤及NLRP3炎症小体在肝脏放射损伤中的作用鲜有报道.文中通过Co60γ辐射建立小鼠辐射模型，检测辐射对小鼠肝脏形态、功能及NLRP3炎症小体信号通路的影响．

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性昆明小鼠(20～25 g)购于兰州大学医学院动物实验中心，动物许可证号：SYXK(甘)2018-0002．饲养室内温度保持在23±2 ℃，明暗周期12 h，自由饮水和进食．将小鼠随机分为2组：对照组(Control组)和辐射组(IR组)，每组20只．IR组在兰州维特辐照公司进行8Gy的Co60γ射线全身一次性均匀辐射．

1.2 样本采集

将每组10只小鼠进行灌流固定，取肝脏做苏木精-伊纪(HE)染色和免疫荧光染色；另外10只小鼠眼眶静脉采血后断颈处死，迅速在肝脏取2 mm3大小的组织固定于2.5%戊二醛中用于电镜检测，剩余的肝组织在-80 ℃保存用于免疫印迹(Western blotting)检测．血液样本以2 000 r·min-1离心10 min，取血清送检，其中的丙氨酸氨基转移酶(AST)和天冬氨酸氨基转移酶(ALT)水平作为肝功能的指标．电镜样本的制作、拍照和血清样本的检测均交由武汉赛维尔生物科技有限公司完成．

1.3 肝组织HE染色和免疫荧光染色观察

HE染色：取上述固定的各组小鼠肝组织，进行常规石蜡包埋，连续切片(8 μm)后用HE染色，在显微镜下进行观察及拍照．

免疫荧光染色：石蜡切片经脱腊、修复、封闭后用NLRP3一抗(兔抗-NLRP3，博奥森)4 ℃孵育过夜，用荧光素标记的二抗异硫氰酸荧光素(FITC)37 ℃孵育30 min后,再用4,6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)染液室温孵育15 min，最后用甘油缓冲液封片，在荧光显微镜下观察拍照．

1.4 Western blotting检测相关蛋白表达

将-80 ℃冻存的肝脏组织按照提取总蛋白的方法提取肾总蛋白，用二辛酸(BCA)法对蛋白进行定量．取蛋白于10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，湿转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上．5%脱脂奶粉封闭1 h，将一抗(NLRP3， Caspase-1,IL-1β)4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜5次，每次5 min；二抗室温摇床孵育2 h，TBST清洗5次，每次5 min，电化学发光法(ECL)检测液放射自显影．显影结果用Image J进行条带分析，结果用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)校正．各抗体稀释比均为1∶1000．

1.5 统计分析

蛋白数据先用ImageJ进行灰度值取值，收集的数据用SPSS17软件进行处理，单因素ANOVA进行标准误差以及显著性分析，最后用Origin 7.5作图．

2 结果

2.1 肝组织HE染色和透射电镜观察

从肝脏的HE染色可以看出(图1)，肝细胞排列成索状，围绕中央静脉呈放射状排列，肝细胞索有分支，彼此吻合成网．相较于对照组，辐射组的肝脏表现出肝细胞索排列紊乱，肝窦明显变宽且肝细胞形状发生空泡变性，呈现病理特征．

注：箭头指向肝窦；三角指向空泡变性

用透射电镜观察辐射对小鼠肝细胞的病理损伤的影响．如图2所示，对照组正常肝细胞的超微结构特点为：细胞核圆润，线粒体、粗面内质网、糖原颗粒分散在细胞质中，肝细胞间可见胆管并且肝细胞间细胞边界明显．辐射组相对于对照组细胞核固缩，糖原颗粒的随机散布变少，肝细胞边缘消失，细胞质呈海绵状，粗面内质网明显扩张，胆管管腔内可见电子致密物(黄色箭头)．表明辐射可以引起肝脏组织超微结构的损伤．

N：肝细胞核；cb：细胞边界；箭头所指为胆管

2.2 对肝功能生化指标的检测

ALT和AST是肝功能损伤检测的重要指标．ALT参与人体蛋白质新陈代谢，可加快体内氨基酸的转移，主要存在于肝细胞的细胞浆；AST能促进蛋白质氨基转化作用．如图3所示，IR组小鼠血清ALT(图3a)和AST(图3b)明显高于Control组(P<0.001)．说明辐射会引起肝脏功能损伤，辐射后肝脏会发生代谢功能改变，辐射诱导肝细胞释放化学物质，随后进入血液循环．

与对照组相比， ***P<0.001

2.3 肝组织中NLRP3表达情况

NLRP3是NLRP3炎性小体的重要配件，在肝细胞的胞浆中表达，免疫荧光法检测其阳性表达位于胞浆．如图4所示，细胞质中的NLRP3阳性表达为绿色荧光，肝细胞的核进行DAPI染色呈蓝色荧光，将二者融合得到Merge图像，检测NLRP3炎性小体在肝细胞中的位置和表达情况．结果发现对照组中NLRP3阳性细胞很少，辐射组的阳性表达对比对照组的NLRP3阳性表达明显升高，说明辐射可以激活肝脏NLRP3炎性小体．

图4 对照组和辐射组肝脏NLRP3(绿色)免疫荧光表达(400×)

2.4 肝组织中的NLRP3，IL-1β，Caspase-1的蛋白表达

为检测辐射诱导激活NLRP3炎症信号通路，测定了肝组织中的NLRP3，IL-1β，Caspase-1的蛋白表达变化．如图5所示，与对照组相比，辐射处理后NLRP3，IL-1β，caspase-1蛋白表达量明显呈上升趋势，具有极显著性差异(分别为P<0.01，P<0.001，P<0.001)．结果提示，辐射可以激活肝脏NLRP3炎性小体通路．

a为NLRP3，Caspase-1，IL-1β在肝组织的Weastern Blotting的结果； b，c，d分别为小鼠肝中NLRP3， Caspase-1，IL-1β蛋白的相对灰度值变化统计图，以GAPDH为内参(**P<0.01， ***P<0.001)

3 讨论

研究表明,4.5 GHz手机辐射电磁场可使大鼠肝脏组织出现窦样扩张、局灶性滤过、枯否细胞减少、肝细胞脂肪变性等[12]．频率为2.45 GHz的电磁场中大鼠肝脏组织会出现中度充血、肝窦扩张、肝小叶内小的炎性球囊炎，电镜下可见肝细胞有不同大小和形状的囊泡、脂滴和光滑内质网的增生[13]．本实验HE染色病理检测结果表明，相较于对照组，辐射组的肝脏表现为肝细胞索排列紊乱、肝窦明显变宽且肝细胞形状发生气球样变；超微结构也表现出核固缩、肝细胞边缘消失、细胞质呈海绵状等变化，这与有关研究结论一致[14-15]，说明Co60γ照射可对小鼠肝脏造成形态学损伤．在暴露于电磁场的母鼠所生的仔鼠肝脏辐射模型中，ALT和AST水平明显升高[16]．ALT与AST为临床肝功能检测指标，其含量增高常常与肝损伤程度成正比．Eassawy等研究表明，过量使用APAP或γ射线治疗大鼠会引起肝毒性，导致肝酶活性(ALT，AST,碱性磷酸酶，谷胺酰转肽酶，乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶)显著增加[17]．本实验结果表明，辐射组血清中ALT，AST水平较对照组极显著升高，这与Abou-Zeid等的研究结果一致[18]，表明Co60γ照射可对肝功能造成损伤．

炎症小体既能识别病原相关分子模式，又能识别宿主来源的危险信号分子，所以通常被认为是一种大型的细胞内信号转导平台，其中包含胞质模式识别受体，尤其是核苷酸结合的寡聚化域样受体(NLR)或黑色素瘤中缺失的一种2型受体(AIM2)[19]．在NLR炎性小体复合物中，NLRP3炎性小体的作用最为突出，NLRP3炎性小体可以调控两种促炎白细胞介素-1家族细胞因子IL-1β和IL-18的激活，IL-18和IL-1β的积累通过募集嗜中性粒细胞和加速肝脏病理而充当促炎介质[20-21]．NLRP3炎症小体的激活和组装机制仍存在争议，目前普遍认为NLRP3炎症小体有3种激活模式：第1种激活模式认为ATP作为NLRP3激动剂，使细胞外的NLRP3激动剂进入细胞质，参与NLRP3的形成；第2种激活模式认为颗粒结构或晶体结构，包括石棉、尿酸钠、硅、淀粉样蛋白可作为激动剂，吞噬细胞吞噬这些激动剂导致溶酶体损伤，进而导致溶酶体内容物的胞质释放，通过组织蛋白酶依赖的NLRP3配体过程；第3种激活模式中，所有的病原相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)都会触发活性氧(ROS)的产生．硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)是NLRP3的配体，且对ROS敏感．在正常生理条件下，氧化还原酶硫氧还蛋白(TRX)与TXNIP结合，并抑制其活性；当细胞内ROS浓度增加时，该复合物解离，TXNIP与NLRP3(主要是亮氨酸富集的重复区LRRs结构域)结合进而触发NLRP3炎症小体的形成[2]．在NLRP3与肝脏相关的研究中发现，在非酒精性脂肪肝炎(NASH)患者中，NLRP3和IL-1β水平与肝纤维化呈正相关，而且NASH的发展与肝细胞内NLRP3炎性小体的激活和Kupffer细胞内Caspase-1的激活有关[22-23]，Casp1基因敲除小鼠和Kupffer细胞衰竭的野生型小鼠表现出较轻的饮食诱导的脂肪性肝炎[24-25]；在不同小鼠食源性脂肪肝模型中，NLRP3和成熟IL-1β水平升高也与肝纤维化呈正相关[26]．此外，Nlrp3基因敲除小鼠表现出明显的肝损伤和纤维化保护作用，而三苯氧胺诱导的Nlrp3敲除小鼠表现为肝损伤和纤维化的加速[27-28]．还有研究表明，药物抑制剂BAY 11-7082抑制NLRP3激活降低了Caspase-1以及IL-1β生产，从而减少和改善食源性肝病[29]；番茄红素通过促进Nrf2/HO-1通路的激活，进一步抑制NLRP3炎症体，减轻肝脏损伤[30]．

研究表明，机体中的水大约占了80%以上，而辐射损伤主要来自于水的辐射分解，进而诱导产生ROS，因而ROS是放射后正常组织损伤的主要来源[31]．线粒体障碍、mtDNA和mtROS的释放是NLRP3炎性小体激活的重要触发因素，NLRP3激活因子诱导NLRP3进行自身寡聚化，招募凋亡相关斑点样蛋白(ASC)，后者组装成丝状结构招募并使pro-Caspase-1自身剪切活化，活化的Caspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，使之成熟并引起下一步炎症反应．本实验研究结果表明，辐射后，肝脏内NLRP3，IL-1β，Caspase-1蛋白表达量明显呈上升趋势，结合已有文献可以推测，当机体暴露在辐射下时，受损的线粒体会释放ROS，激活NLRP3炎性小体通路，进而激活Caspase-1，产生炎性细胞因子IL-1β，并在体内聚集从而引起肝功能损伤.因而，可以NLRP3为作用靶点，通过抑制NLRP3炎性小体的激活，减轻辐射诱导的肝损伤．