薯蓣皂苷元对心肌缺血再灌注损伤大鼠细胞凋亡的影响及相关机制的分析
2022-06-02蒋先训张凯张鹰
蒋先训，张凯，张鹰
心肌缺血再灌注损伤（MIRI）指在一段时间的缺血后，血液供应尽管恢复到心脏组织，但同时对心肌造成额外损害的组织损伤[1-2]。炎症是心肌再灌注引起的微血管损伤和功能障碍的关键特征[3]。NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体为由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1（Caspase-1）组装的一种分子复合物[4-5]，在心肌缺血损伤过程中，NLRP3 炎性小体被激活，加剧炎症反应。已有报道药物可通过抑制NLRP3 炎性小体介导的细胞凋亡和炎症反应减轻MIRI[6]。薯蓣皂苷元是一种植物源性皂苷元，可从野生山药、葫芦巴、大豆等多种植物中分离得到，具有降血糖、降血脂、抗炎和抗氧化等作用[7]。Ebrahimi 等[8]研究发现，薯蓣皂苷元可通过线粒体腺嘌呤核苷三磷酸敏感性钾离子通道，减轻心肌再灌注损伤引起的炎症反应，表明薯蓣皂苷元对MIRI 有治疗作用。但薯蓣皂苷元是否还能通过其他机制发挥对MIRI 的治疗作用目前尚不清楚。因此，本研究通过构建MIRI 大鼠模型，探究薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠的药效作用，并初步分析其对NLRP3/caspase-1 通路的影响，进一步完善薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF 级雄性SD 大鼠，6 周龄，200～220 g，购自南华大学，许可证号：SCXK(湘) 2020-0003，常规饲养1 周后进行实验。本研究动物实验方案经南华大学衡阳医学院附属第二医院伦理委员会批准，并按照动物护理和使用的指导方针进行的。
1.2 主要试剂
薯蓣皂苷元标准品（纯度≥98%，SD8360）和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液（G3005）购自北京索莱宝生物科技有限公司。苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（C0105）和TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（C1082）购自上海碧云天生物有限公司。白细胞介素-6（IL-6），白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。NLRP3 一抗、Caspase-1 一抗、ASC 一抗、IL-1β 一抗及二抗购自赛信通（上海）生物试剂有限公司。
1.3 实验仪器
包括生物信息收集系统（BL-410，日本Nihon Kohden 公司）；小动物呼吸机（DH-140，浙江大学医疗器械厂）；显微镜（E400，日本Nikon 公司）；石蜡切片机（HHL210，德国Leica 公司）；电泳仪（DYY-6C，北京六一仪器厂）；蛋白凝胶成像仪（AlphaImager HP，美国 Alpha Inotech 公司）。
1.4 实验方法
1.4.1动物模型制备
根据参考文献[9]的方法，采用左前降支结扎模型建立MIRI 大鼠模型。将大鼠麻醉，以仰卧固定在手术台上，并连接标准的导联心电图。切开颈部中间并连接动物呼吸机以进行通气（呼吸频率60 次/min，潮气量8.0 ml，频率5：4）。气管内插管后，将左颈总动脉分离并置入导管中，并通过压力传感器连接到生物信息收集系统。进行左胸廓切开术和心包切开术以暴露心脏。将左前降支临时结扎30 min，以达到局部缺血。通过心电图ST 段抬高或移位和心脏缺血区（前心室壁和心尖部）颜色的改变，证实左前降支结扎成功。然后再灌注120 min，诱发心肌缺血再灌注损伤。假手术组仅穿线不结扎。
1.4.2动物分组及给药
将造模成功的72 只SD 大鼠，按照随机数字表法分成MIRI 组、薯蓣皂苷元低、中、高剂量组（分别给予50 mg/kg、75 mg/kg、100 mg/kg 的薯蓣皂苷元），每组18 只。再另取18 只大鼠做假手术组处理。分别于造模后给予薯蓣皂苷元低、中、高剂量组灌胃[10]，生理盐水制备不同浓度的薯蓣皂苷元，灌胃体积为10 ml/kg，每日1 次，连续4 周。假手术组和MIRI 组给予等体积生理盐水灌胃。
1.4.3心脏功能测定
记录每组大鼠在不同时间段的心脏血液动力学参数。大鼠右侧颈总动脉插管至左心室，并连接压力传感器通过BL-410 生物信息收集系统，记录并分析左心室收缩压（LVSP），左心室舒张末期压力（LVEDP），左心室射血分数（LVEF），短轴缩短率（FS）及最大收缩/舒张期压力变化速率（±dp/dtmax）。
1.4.4心肌梗死面积的测量
从每组大鼠随机选择6 只，再次结扎左前降支，左侧颈总动脉注入1%伊文思蓝1 ml。取出心脏，用预冷生理盐水反复冲洗，在-70℃快速冷冻，切成约1～2 mm 厚的薄片，置于1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中，37℃水浴孵育15～30 min，10%甲醛固定10 min。拍摄照片，使用Image Pro Plus 软件计算左心室梗死面积百分比。
1.4.5心肌组织病理学检测
每组随机选取6 只大鼠，将心脏组织置于10%福尔马林中固定24 h，分级脱水，切成5 μm 厚度的切片，使用HE 染色试剂盒对切片进行染色，并于光学显微镜下分析心肌组织的形态学变化。
1.4.6检测心肌细胞凋亡指数
利用TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒对心肌细胞的凋亡情况进行检测。操作步骤为：取1.4.5 制备的石蜡切片，脱蜡，蛋白酶消化20 min 后清洗，加入TUNEL 反应混合液，于37℃下封闭30 min，加底物显色，HE 复染，脱水，封片。观察并计算：凋亡细胞率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。
1.4.7检测血清炎性因子含量
将收集的血清根据ELISA 试剂盒说明书操作，检测各组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量。
1.4.8大鼠心肌组织中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表达水平测定
将每组剩余的6 只大鼠的心脏取出，液氮速冻研磨，加入裂解液制成匀浆，提取总蛋白，使用二辛可宁酸（BCA）试剂盒定量后，经SDS-PAGE 电泳后转膜，封闭加一抗（NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、β-肌动蛋白，稀释倍数1：500），4℃过夜孵育后清洗，加二抗，在室温下孵育2 h，清洗曝光显色，分析条带的灰度值。
1.5 统计学方法
采用SPSS 25 软件进行数据分析。所有数据均用均数±标准差表示。数据首先用单因素方差分析进行分析，然后进行后处理的Bonferroni 检验。P＜0.05 被认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心功能的影响（表1）
表1 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心功能的影响（,n=18）
表1 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心功能的影响（,n=18）
注：MIRI：心肌缺血再灌注损伤；LVSP：左心室收缩压；LVEDP：左心室舒张末期压力；LVEF：左心室射血分数；FS：短轴缩短率；+dp/dtmax：最大收缩期压力变化速率；-dp/dtmax：最大舒张期压力变化速率。与假手术组比*P＜0.05；与MIRI 组比△P＜0.05；与薯蓣皂苷元低剂量组比▲P＜0.05；与薯蓣皂苷元中剂量组比#P＜0.05。1 mmHg=0.133 Kpa
与假手术组相比，MIRI 组大鼠LVEDP 显著升高（P＜0.05），LVSP、LVEF、FS 及±dp/dtmax显著降低（P均＜0.05）；与MIRI 组相比，薯蓣皂苷元低、中、高各剂量组大鼠LVEDP 均显著降低（P均＜0.05），LVSP、LVEF、FS 及±dp/dtmax均显著升高（P均＜0.05）。
2.2 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心肌梗死面积的影响（表2）
表2 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心肌梗死面积的影响（,n=6）
表2 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心肌梗死面积的影响（,n=6）
注：MIRI：心肌缺血再灌注损伤。与假手术组比*P＜0.05；与MIRI 组比△P＜0.05；与薯蓣皂苷元低剂量组比▲P＜0.05；与薯蓣皂苷元中剂量组比#P＜0.05
MIRI 组大鼠心肌梗死面积明显高于假手术组（P＜0.05）,而经过不同剂量薯蓣皂苷元干预的大鼠心肌梗死面积均显著降低（P＜0.05）。
2.3 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心肌组织病理变化的影响
MIRI 组大鼠心肌组织局部变性坏死，肌纤维紊乱、断裂溶解，间质充血水肿，并伴有炎细胞浸润；薯蓣皂苷元各剂量组随剂量增加而心肌损伤依次减轻，其中薯蓣皂苷元高剂量组大鼠心肌组织中肌纤维排列整齐，部分肌束间隙增宽，间质轻度肿胀，仅少量炎性细胞浸润，见图1。
图1 各组大鼠心肌组织形态学变化（×400）
2.4 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心肌细胞凋亡指数的影响（表3）
表3 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心肌细胞凋亡指数的影响（,n=6）
表3 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心肌细胞凋亡指数的影响（,n=6）
注：MIRI：心肌缺血再灌注损伤。与假手术组比*P＜0.05；与MIRI 组比△P＜0.05；与薯蓣皂苷元低剂量组比▲P＜0.05；与薯蓣皂苷元中剂量组比#P＜0.05
与假手术组相比，MIRI 组大鼠心肌细胞凋亡指数显著升高。与MIRI 组相比，薯蓣皂苷元低、中、高剂量干预组大鼠心肌细胞凋亡指数均显著降低[（49.49±6.27）% vs.（37.56±4.98）%，（49.49±6.27）% vs.（28.35±3.64）%，（49.49±6.27）%vs.（16.93±2.25）%，P均＜0.05]。
2.5 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠血清中炎性因子水平的影响（表4）
表4 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠血清中炎性因子水平的影响（pg/ml，±s，n=12）
MIRI 组大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明显高于假手术组（P均＜0.05），而经薯蓣皂苷元低、中、高剂量干预后，IL-6、IL-1β、TNF-α 水平显著降低（P均＜0.05）。
2.6 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心肌组织中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表达水平的影响（图2、表5）
表5 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心肌组织中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表达水平的影响（,n=6）
表5 薯蓣皂苷元对MIRI 大鼠心肌组织中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表达水平的影响（,n=6）
注：MIRI：心肌缺血再灌注损伤；NLRP3：NOD 样受体蛋白3；Caspase-1：半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1；ASC：凋亡相关斑点样蛋白；IL-1β：白细胞介素-1β；β-actin：β-肌动蛋白。与假手术组比*P＜0.05；与MIRI 组比△P＜0.05；与薯蓣皂苷元低剂量组比▲P＜0.05；与薯蓣皂苷元中剂量组比#P＜0.05
图2 各组大鼠心肌组织蛋白免疫印迹条带图
与假手术组相比，MIRI 组大鼠心肌组织中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表达水平显著升高（P均＜0.05）；与MIRI 组相比，薯蓣皂苷元各剂量组大鼠心肌组织中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表达水平显著降低（P均＜0.05）。
3 讨论
MIRI 在世界范围内有严重的发病率和死亡率，发病机制涉及多种机制的相互作用，包括钙超载、氧化应激损伤、心肌细胞自噬和细胞凋亡等[11-12]。众所周知，对缺血后炎症的先天免疫反应在MIRI 的病理生理中起着重要作用[13]，但与心脏损伤相关的机制仍有待于进一步研究。LVEDP 和LVSP 是左心室舒张收缩功能的重要指标，±dp/dtmax反映左心室收缩和舒张期运动速度，受左心室心肌细胞效率的影响[14]。本研究通过建立MIRI 大鼠模型，经HE 染色后观察可发现，MIRI 大鼠心肌组织局部变性坏死，间质充血水肿，并伴有炎细胞浸润。TTC 法检测到心肌梗死面积增加，TUNEL 法检测到心肌细胞凋亡指数增加，ELISA 结果显示血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平升高。BL-410 生物信息收集系统观察到LVEDP 升高，而LVSP、LVEF、FS 及再灌流期间的±dp/dtmax降低，表明模型建立成功。
薯蓣皂苷元是由藤井和松川于1935 年在山萆薢中首次发现的，是一种天然的甾体皂甙元[15]。薯蓣皂苷元在传统医学中已被用作膳食补充剂，用于治疗高血糖、高脂血症、炎症和胃肠道疾病等问题[16]。薯蓣皂苷元可通过上调CX-43 的表达和激活来减轻心肌缺血/再灌注诱发的室性心律失常[17]。本研究结果发现，与MIRI 组相比，薯蓣皂苷元各剂量组大鼠经HE 染色后观察到心肌损伤明显减轻，仅少量炎性细胞浸润，ELISA 结果也显示IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎性因子水平降低，BL-410 生物信息收集系统检测的各项心功能指标也明显逆转，表明薯蓣皂苷元可显著改善MIRI 大鼠的损伤情况，减少炎症反应及细胞凋亡，改善左心室的泵血效率。
NLRP3 炎性小体激活在MIRI 中起重要作用，当其被激活时，NLRP3 与ASC 形成炎性复合物，从而控制Caspase-1 的激活，并随后促进促炎性细胞因子（如IL-1β 和IL-18）的分泌，最终导致细胞损伤和死亡[18]。NLRP3 炎性小体可促进心脏微血管内皮细胞的心肌缺血再灌注损伤，miR-377-5p 可靶向抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β 信号通路，从而减轻心肌缺血再灌注损伤和缺氧/复氧心肌细胞凋亡[19]。在脑缺血/再灌注损伤大鼠中，D-香芹酮可抑制TLR4/NLRP3 信号通路，减轻脑损伤[20]。在微血管再灌注损伤大鼠中，天麻素亦可通过调节NLRP3/Caspase-1 途径，改善再灌注引起的细胞凋亡[21]。在本研究中，Western blot 结果发现心肌组织中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表达水平在MIRI 大鼠中明显升高，而在薯蓣皂苷元作用下，心肌组织中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表达水平明显降低，表明薯蓣皂苷元可能通过抑制NLRP3/Caspase-1 通路，减轻MIRI 大鼠的炎症反应。
综上所述，薯蓣皂苷元的应用可改善MIRI 大鼠的左心功能，减少心肌梗死和细胞凋亡，保护心肌免受缺血再灌注损伤，该作用可能与抑制NLRP3/Caspase-1 信号通路有关。然而，本研究结果仅说明减轻MIRI 大鼠的心肌损伤与抑制NLRP3/Caspase-1通路有关，不能说通过抑制NLRP3/Caspase-1 通路而减轻MIRI 大鼠损伤，后续将对此方面补充细胞实验，采用NLRP3 活化的选择性抑制剂等对缺氧复氧心肌细胞进行相关研究。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突
