长短光照桃小食心虫保幼激素动态及相关基因在脱果时的表达差异

李永丽， 周洲， 尹新明

(1.信阳农林学院农学院，河南 信阳 464000； 2. 河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002)

滞育(diapause) 通常是因昆虫受到不利环境变化的某种信号刺激，引起其体内一系列基因和蛋白质编码过程的改变，从而导致其生长发育或生殖停滞的一种现象；是漫长的进化过程中，昆虫对环境条件不断适应和环境对昆虫个体的选择而形成的遗传特性[1]。诱导昆虫发生滞育的环境因子主要包括光周期、温度和食物等。在自然界中，光周期的变化规律最稳定，所以从光照刺激的信号意义来看，光周期比其他环境因素具有更大的优越性[2]。目前，越来越多的研究证实，光周期是多数昆虫进入滞育的最主要环境因子。桃小食心虫CarposinasasakiiMatsumura (桃小)属鳞翅目果蛀蛾科，在中国24个省市均有分布，是危害面积最大、发生最普遍的果树食心害虫[3]。桃小卵孵化后，幼虫会很快钻蛀果实，以苹果为寄主的桃小形成了兼性滞育[4]，光周期是调控其滞育发生的关键因子[5]，在长光照(光周期14L∶10D)条件下脱果的老熟幼虫在土壤中结长茧，随后在长茧内化蛹，蛹期结束后，桃小蛹移动至长茧前端羽化成虫；在短光照(光周期12L∶12D)条件下脱果的老熟幼虫在土壤中结圆茧滞育，圆茧内一直保持幼虫状态，到滞育解除幼虫才咬破圆茧出土，在土中重新结成长茧化蛹，羽化后繁殖下一代[6-7]。

在昆虫中，咽侧体 (corpora allata，CA) 合成的保幼激素 (juvenile hormone，JH) 与前胸腺 (prothoracic glands，PG) 合成的20羟基蜕皮酮 (20-hydroxyecdysone，20E) 是2种最重要的激素，二者动态调节着幼虫生长和变态发育。幼虫滞育已有的理论认为，幼虫血淋巴高水平的JH在滞育过程中抑制了脑―前胸腺轴的活化，阻止了20E合成释放，从而导致幼虫生长停滞和化蛹[8]；在缺乏来自前胸腺的20E时，幼虫不能启动下一次蜕皮，原因通常是由于大脑分泌 PTTH 的减少[9]。JH 有助于维持幼虫生长，经过咽侧体分泌腺合成并分泌至血淋巴中，与保幼激素结合蛋白 (juvenile hormone binding protein，JHBP) 结合并被运送到靶器官，进而调控相关代谢过程。蜕皮过程始于大脑神经分泌细胞合成释放促前胸腺激素 (prothoracicotropic hormone,PTTH)，PTTH刺激前胸腺分泌蜕皮激素 (ecdysone)[10]。蜕皮激素在 PG 中合成并最终转化成活性最高的20E，引发幼虫蜕皮和变态发育[11]。本研究采用 Illumina HiSeqTM 4000 测序平台测定了2种生长条件下老熟幼虫转录组，为桃小相关分子生物学研究奠定基础；qPCR 验证转录组数据的准确性，并筛选差异表达的 JH 相关基因；然后结合两种发育方向 JH 丰度变化差异，进一步探讨这些 JH 相关基因在此过程中的作用，为深度解析 JH在调控桃小滞育形成过程中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

供试桃小于2017 年7月采自洛阳市孟津县苹果园，带回实验室于人工气候箱 (上海一恒MGC-250P) 内饲养，饲喂苹果传代。设置 (25±1) ℃、相对湿度 (60±5)%，短光照 (12L∶12D) 或长光照 (14L∶10D) 2种光周期条件。

1.2 桃小 JH 含量测定

收集不同发育阶段和不同滞育状态的虫体，包括长(短)光照幼龄到初脱果幼虫；长(短)光照脱果1～8 d蛹和幼虫。短光照幼虫脱果1 d后结圆茧，最初10 d在圆茧里比较活跃，人为破坏茧壁完整性之后幼虫很快从茧中爬出；10 d后幼虫进入低活跃状态，人为破坏茧壁完整性之后幼虫不从茧中爬出，处于滞育维持阶段；70 d以后达到滞育结束状态，圆茧转移到 25 ℃ 条件下一段时间后可以出土活动，90 d以后出土活动更为集中。因此，实验中取保存在8 ℃沙土中的短光照脱果滞育10、40、70、90、120、140及160 d滞育圆茧内的幼虫，包含了不同滞育状态的虫体，液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱冻存备用。取保存幼虫置于1.5 mL离心管中称质量，脱果老熟幼虫3头合并称质量，2龄及3龄桃小幼虫虫体每组10～12头合并称质量。在每支样品管中按单组虫质量的10倍加入蒸馏水稀释，使用玻璃研棒快速充分研磨虫体。超声波细胞破碎仪 (宁波 新芝，650E) 冰浴破碎 5 min (超声设置：50 W，每次 2 s，间隔 2 s)，涡旋震荡混匀 30 s， 4 ℃ 条件下 5 000 r·min-1离心 20 min (湖南 湘仪，H1850R)，取上清液。使用 ELISA 试剂盒 (上海 酶免，MM-086301) 测定 JH 含量，操作步骤参照试剂盒说明书。

1.3 文库制备与转录组测序分析

按照 RNAiso Plus (Takara，Code No. 9108) 方法提取样品总 RNA，长光照和短光照条件下脱果老熟幼虫各3只，3只幼虫含头部的前三分之一虫体分别提取。文库构建与测序由北京百迈客生物科技有限公司协助完成。RNA质检合格后，使用NEB 7530试剂盒 (New England Biolabs，美国) 进行文库构建，文库质检 (DNA 1000 assay Kit，Agilent，美国) 合格后，每个样品构建一个300～500 bp片段长度的双端 (paired-end，PE) 测序文库，合格的 cDNA 文库用 Illumina Hiseq 4000 进行高通量测序。经原始数据测序质控，基于基因组注释的定量质控、基因分析、表达量统计等步骤[12]，获得基因表达的FPKM 值对应 unigene 的表达丰度。

1.4 JH 相关差异表达基因的筛选及 qPCR 验证

根据2种光照条件下脱果老熟幼虫差异表达基因的功能注释信息，结合已有相关文献报道，筛选与保幼激素合成代谢关系较密切的功能基因，进行荧光定量 PCR (qPCR) 验证转录组结果的可靠性。使用 1.2 的方法采集样品 (每个样品设 3 次生物学重复和 3 次技术重复) ，制备 qPCR 验证试验样品。从转录组数据中挑选出 7 个保幼激素合成代谢表达差异基因，分别为保幼激素酸甲基转移酶 (juvenile hormone acid O-methyltransferase，jhamt)、保幼激素环氧水解酶 (juvenile hormone epoxide hydrolase，jheh) 和保幼激素结合蛋白 (haemolymph juvenile hormone binding protein，jhbp)，以 (elongation factor 1-alpha，ef-1a) (GenBank 登录号: MH250149) 为内参基因[13]进行 qPCR。qPCR 反应体系参照 TB GreenTMPremixExTaqTM(大连，Takara) 说明书。qPCR 反应程序: 95 ℃预变性 2 min；95 ℃ 变性 10 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 10 s，40 个循环；接着 65～95 ℃ 溶解曲线。检测分析它们在长光照和短光照条件下脱果老熟幼虫中的相对表达量。引物设计见表1。

表1 实时荧光定量 PCR 引物

2 结果与分析

2.1 不同光照条件下桃小脱果老熟幼虫 JH 滴度变化

桃小在短光照和长光照条件下分别进行的是滞育和非滞育发育过程。短光照和长光照条件下，2种光周期下幼虫生长过程 JH 滴度没有差异，JH 滴度均是从2龄到 5 龄脱果每龄逐渐降低，在脱果时达到最低，分别为 1.261和 1.319 ng·g-1。但是随着进入圆茧和长茧，JH滴度发生了明显差异，仅在 1 d后，长光照幼虫进入蛹期 1 d的 JH 滴度快速上升了 3 倍，达到了 3.821 ng·g-1，说明桃小从脱果幼虫到蛹的变态过程需要 JH 的滴度上升(图1)。而短光照幼虫在刚进入圆茧滞育 1 d，JH 滴度少量上升至 1.529 ng·g-1，显著低于非滞育发育的试虫。经历了长光照的幼虫随后进入蛹期至第8天羽化，JH 滴度在第1、4和8天处于峰值，期间有升降的动态变化，但 JH 滴度保持在较高水平(2.651～5.115 ng·g-1)，均高于滞育发育同时期的试虫。经历短光照的桃小脱果后进入圆茧滞育，JH 滴度在前 4 d缓慢升高至 3.553 ng·g-1，在第 4、7 和10天处于峰值，期间也有降低和升高的变化，最高值为第10天的 6.261 ng·g-1；在后续的滞育持续阶段，JH 滴度是维持在低水平，圆茧90 d后JH滴度达到低值 2.226 ng·g-1，滞育达到可解除状态，圆茧转移到 25 ℃ 条件下很快可以出土活动；随后 JH 滴度逐渐上升，160 d的JH 滴度升至的 7.442 ng·g-1。

注：*表示同一时间点的滞育和非滞育发育虫体JH滴度差异显著(P<0.05)。

2.2 不同光照条件下桃小老熟幼虫基因差异表达分析

采用Illumina HiSeqTM 4000高通量测序平台共获得44.35 Gb(GenBank 登录号: PRJNA495711)有效转录组(去除接头序列、质量差的序列等)数据。将获得的 unigenes 序列用 BLASTX 程序与 COG，GO，KEGG，KOG，Pfam，Swiss-prot eggNOG 和 Nr 数据库进行对比，得到桃小短光照老熟幼虫转录组 unigene 的功能信息。在组装获得的 56 723 条 unigenes 中成功注释 27 180 条，所占比例为 47.92%；COG 数据库注释 6 958 条 unigenes，占总体的 25.60%，比例最高； GO 数据库注释 6 755 条 unigenes，占总体的 24.85%，比例最高；KEGG 数据库注释 10 951 条unigenes，占总体的 40.29%，比例最高；Pfam 数据库注释 18 301 条 unigenes，占总体的67.33%；Swiss-prot 数据库注释 12 565 条unigenes，占总体的 46.23%；eggNOG 数据库注释 24 961 条 unigenes，占 91.84%，比例最高；Nr 数据库成功注释 24 009 条 unigenes，占 88.33%。

检测短光照和长光照条件下脱果老熟幼虫差异表达基因时，采用 DESeq2 进行样品组间的差异表达分析，采用了 FDR (false discovery rate)作为差异表达基因筛选的关键指标，将 FDR 小于 0.01 且差异倍数 FC (fold change) 大于等于 2 作为筛选标准。短光照条件下脱果老熟幼虫下调基因 442 个，上调基因 551 个，51 625 个基因表达没有明显变化 (图2)。

根据已有 unigenes 的功能注释结果，分析基因差异表达的模式。短光照饲养条件下脱果老熟幼虫表达下调基因 (图3 A) 较多属于E 类 (氨基酸运输与代谢)，G类 (碳水化合物转运和代谢)，I 类 (脂类转运和代谢)，K类 (转录功能)，L类 (修复、重组和修复)，M类 (细胞凋亡)，O 类 (翻译后修饰、蛋白转运及蛋白伴侣)，Q类 (次生物质代谢、转运和催化)，R 类 (具有一般功能)。短光照饲养条件下脱果老熟幼虫头部上调基因 (图2-B)较多属于V 类 (保护机制功能)，Q类 (次生物质代谢、转运和催化)，I 类 (脂类转运和代谢)，H类(同工酶运输和代谢)。

注：差异表达火山图中的每个点表示1个基因，绿色和红色的点代表有显著性表达差异的基因，绿色代表基因表达量下调，红色代表基因表达量上调，黑色的点代表无显著性表达差异的基因。

注：a,短光照表达上调基因类型; b,短光照表达下调基因类型。

2.3 不同光照条件下桃小脱果老熟幼虫 JH 合成代谢差异基因 qPCR 验证

比较短光照和长光照饲养条件下脱果老熟幼虫发现，2个相同虫态存在 993 个差异表达基因，包括 7 个保幼激素合成代谢相关的基因。其中 6 个下调，1 个上调 (表2) 。

表2 短光照和长光照饲养条件下脱果老熟幼虫 JH 合成代谢差异表达的7 个基因

对这 7 个差异表达基因进行了 qPCR 验证，验证结果与转录组结论一致。试验结果表明，jhamt在长光照老熟幼虫头部表达量是短光照的 3.4 倍；jheh1、jheh2、jheh3和jheh4在长光照老熟幼虫头部表达量分别是短光照的 19.6、1.9、4.3 和 0.4 倍；jhbp1和jhbp2在长光照老熟幼虫头部表达量分别是短光照的 2.7 和 20.5 倍 (图 4)。

注：LL 长光照下脱果老熟幼虫， SL 短光照下脱果老熟幼虫，*代表差异显著(单因素方差分析，Duncan，P<0.01)。

3 结论与讨论

研究表明 JH 在不同幼虫滞育中作用并不完全相同。在西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)中，JH的滴度在整个幼虫滞育期一直持续升高，仅在 JH 滴度下降时滞育才终止[14]。但在竹螟(Omphisafuscidentalis)幼虫滞育过程中，血淋巴中的 20E 滴度非常低[15]；将保幼激素类似物 (JHA) 局部应用于竹螟滞育幼虫，会引起血淋巴中 20E 滴度的上升，进而可导致化蛹[16]。而在欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)中，JH 滴度在滞育早期时含量高，但随后在剩余的整个滞育期内含量下降，并保持持续的低水平[17]。本研究发现，长光照与短光照桃小老熟幼虫脱果初期 JH 滴度没有显著差异，2种桃小脱果老熟幼虫 JH 滴度均处于低水平，随后在进入圆茧和长茧的过程 JH 滴度都是上升的过程，但是长光照老熟幼虫进入长茧化蛹 JH 滴度升高的量更多，JH含量1 d 后增加了 3 倍，说明桃小从脱果幼虫到蛹的变态过程需要 JH 的滴度上升。而短光照幼虫在刚进入圆茧滞育 1 d，JH 滴度显著低于非滞育发育的试虫。经历了长光照的幼虫JH 滴度在第 1、4 和 8天处于峰值，期间有升降的动态变化，但 JH 滴度保持在较高水平，均高于滞育发育同时期的试虫。经历短光照的桃小脱果后进入圆茧滞育，JH 滴度在第 4、7 和 10天处于峰值，期间也有降低和升高的变化，最高值为第10天；在后续的滞育持续阶段，JH 滴度是维持在低水平，圆茧在90 d后滞育达到可解除状态，随后 JH 滴度逐渐上升。

本研究对长光照和短光照条件下桃小老熟幼虫包含头部 1/3 虫体的转录组进行了测序，获得桃小的转录组信息。经过测序质量控制，所有试验样本高质量的数据 (Q30) 均高于 92.77% ，共得到 44.35 Gb 的高质量测序数据。所有转录组测序获得的 reads 组装后，获取 56 723 个 unigenes，平均长度 963.07 bp，而且大部分 unigenes 能比对到亲缘关系较近的物种，说明测序组装质量较好，我们的试验为研究桃小提供了基因组数据参考。昆虫的滞育主要是通过生理生化变化，生成小分子抗冻物质，进而增加细胞膜及蛋白结构稳定性、降低渗透压、降低结冰点，从而保护了昆虫免于受到冷冻低温的伤害[1,18]。本研究对桃小长光照和短光照脱果幼虫差异表达基因进行分析，发现防卫保护和脂类转运代谢相关的基因在短光照条件下呈现表达量升高，这些基因与滞育虫体的抗性相关，这部分结果与昆虫滞育越冬的生理生化响应相关研究吻合[19]。

昆虫的生长发育以及变态受到 JH 的严密调控，JH 先由咽侧体合成并分泌，在咽侧体中JHAMT是合成JH的关键酶[20]。长光照老熟幼虫随着进入长茧化蛹，体内 JH 含量大量提高，这个过程 JHAMT 的高表达是必需的。对比了短日照和长日照桃小老熟幼虫转录组差异，发现 1个jhamt表达存在显著差异，该基因在长日照老熟幼虫中表达量是短日照的 3.4 倍，这证明了长日照老熟幼虫体内JH 的合成水平更高。

JH 是一类疏水性激素，必须在血淋巴中依靠载体蛋白JHBP的运输作用才能在靶器官或靶细胞发挥功能[21]。本研究对比了短日照和长日照桃小食心虫老熟幼虫转录组差异，发现 2 个 JHBP基因表达存在显著差异。jhbp1和jhbp2在长日照桃小老熟幼虫中表达量分别是短日照的 2.7 和 20.5 倍。目前，在家蚕中 JHBP 家族基因进行了系统的研究，总共鉴定到了41个Bmjhbp，该家族不同的jhbp在血淋巴、表皮、脂肪体和生殖腺等中具有一定的组织特异性。其中，BmJHBPd2是整个家蚕JHBP家族中唯一在后部丝腺高量表达基因，与该部位 JH 表达水平具有同步性，BmJHBPd2的人为过表达能够抑制 JH 通路信号的传递[22]。JHE 和JHEH是降解 JH 的关键酶[23-24]。对比短日照和长日照桃小老熟幼虫转录组差异，发现jheh表达存在显著差异，包含 4 个差异表达的jheh。在长光照老熟幼虫体内jheh1、jheh2和jheh3均表达量高，仅jheh4表达量低于短光照老熟幼虫；jheh1、jheh2和jheh3表达绝对量都远高于jheh4。长光照桃小老熟幼虫jheh整体表达水平高，理论上 JHEH 对JH的降解作用更大，但体内 JH 滴度在 1 d 的时间内却升高更多。推测JHAMT 的高表达可能是一个原因；同时jhbp1和jhbp2的高表达能结合新合成的 JH，从而避免合成的 JH 被降解，这可能是第二个原因。jhamt、jheh和jhbp三者共同维持桃小体内 JH滴度的变化，下一步有必要研究这几个jheh和jhbp在桃小中的表达组织特异性，有望更深层次地阐明在桃小滞育形成中这几个基因调节 JH 滴度变化的作用。

本研究发现桃小的 JH 滴度变化趋势跟欧洲玉米螟有些类似，滞育早期时含量高，但随后在剩余的整个滞育期内含量下降，并保持持续的低水平。同时，也发现桃小滞育终止启动发育时JH滴度再次上升。本研究获得了高质量的桃小幼虫转录组数据，初步筛选出脱果老熟幼虫中7 个JH 合成代谢差异表达基因，这些基因与滞育和非滞育发育相关。由于 JH 在幼虫滞育调控模式具有种的特异，下一步有必要对桃小整个滞育发育过程的 JH 合成代谢相关基因表达调控模式展开研究，以期深层次揭示 JH 在桃小滞育过程中的作用机制。