磁微粒化学发光法在食品中 百草枯残留量检测的应用研究

唐 洁，莫 绪，张启韩

（桂林师范高等专科学校，广西桂林 541199）

截止到2020年，包括中国、英国、欧盟、丹麦、俄罗斯及巴西等20多个国家已经禁止或者严格限制使用百草枯。目前国内外应用于禁用农药残留的检测技术为气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱-串联质谱法和免疫分析法等[1]。

色谱分析法由于检测仪器体积庞大，对使用环境及操作者素质都有非常高的要求，同时检测时间过长，只适合在特定的实验室由专业人员进行操作，难以普及推广应用；免疫分析法主要根据体外生成原理，利用抗体作为生化探测器实现对农残的定性和定量分析；其中，采用酶联免疫吸附（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、荧光免疫分析（Fluorescence Immunoassay，FIA）进行检测都查到有相关文献报道。但食品中农药残留的量往往非常低，这些方法由于其检测灵敏度和精密度偏低，因而检测结果达不到国家标准要求的检出率。在免疫分析法中，利用磁微粒化学发光法技术检测百草枯农药残留还未见报道[2]。

本文采用单克隆抗体、AP酶标记以及磁微粒分离技术，建立了百草枯的磁微粒化学发光免疫定量检测方法。该方法是在免疫分析法基础上发展起来的集化学发光、特异性免疫分析及磁微粒分离等技术于一体的新型检测技术，相对于其他传统分析方法，该技术具有灵敏度高、检测范围宽、检测结果准确、检测成本低及易于实现自动化操作等系统性优势，最低可检测到10-18g量级，能及时有效地为监管机构提供监测数据，为政府职能部门监测和控制农药滥用提供现实依据[3-5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三羟甲基氨基甲烷（Tris），西陇化工股份有限公司；氯化钠，西陇化工股份有限公司；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），Sigma有限公司；甘露醇，西陇化工股份有限公司；海藻糖，西陇化工股份有限公司；BRONIDOX-L，天津希恩思生化科技有限公司；吐温20（Tween20），上海联迈生物工程有限公司。试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子天平：AR224CN（奥豪斯仪器有限公司）；冷冻离心机：SF-TGL-20R（上海菲恰尔）；pH计：Sartoriuspp-20；蛋白测定仪：K9840（山东还能科学仪器有限公司）；集热试恒温加热搅拌器：DF-101S （郑州长城科工贸有限公司）；细胞破碎仪：SM-650A（南京舜玛仪器设备有限公司）；制冰机：ZBL-35（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 试剂缓冲液配制

依次称取以上物质溶解到800 mL纯化水里，用盐酸调节pH值为7.4，并定容为1 000 mL的储备液备用，分别为Tris（0.01 mol/L）、氯化钠 （0.15 mol/L）、BSA（0.5 mol/L）、甘露醇（0.5 mol/L）、 海藻糖（0.5 mol/L）、BRONIDOX-L（0.01 mol/L）及Tween20（0.05%）。

1.3.2 检测试剂盒主要组份的制备

检测试剂盒主要组份由试剂R1、试剂R2及标准液组成。

（1）PQ试剂R1配制。生产工艺流程如图1所示，采用抗体偶联操作工艺。①取10.00 mL磁珠微球（固体物10%），磁分离10 min，弃上清，用100 mL 0.5 mol/L、pH 5.0的MES缓冲液重悬，在混匀仪上混匀10 min；磁分离10 min，弃上清，加入100 mL 0.5 mol/L、PH 5.0的MES缓冲液重悬。②称取 100 mg N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），用0.5 mol/L、pH为5.0的MES缓 冲 液充分溶解至10.0 mg/mL；称取50 mg EDC，用 0.5 mol/L、pH为5.0的MES缓冲液充分溶解至 10.0 mg/mL。③在搅拌的条件下，往磁珠微球中先后加入10 mL NHS溶液和5 mL EDC溶液，混匀；④在搅拌的条件下，往磁珠微球中加入百草枯抗体10.00 mg，混匀；⑤磁分离10 min，弃上清，用 100 mL 0.5 mol/L、pH为5.0的MES缓冲液重悬，混匀；⑥磁分离10 min，弃上清，加100.0 mL 10%BSA重悬，混匀；⑦磁分离10 min，弃上清；用100 mL 0.5 mol/L、pH为5.0的MES缓冲液重悬，混匀即得。

图1 R1生产工艺流程图

（2）PQ试剂R2配制。R2生产工艺流程如图2所示， 采用抗原标记操作工艺。①称取5 mg百草枯化合物，12 mg DSS，用200 µL DMSO溶解，再加入10 µL N-甲基吗啉，混合均匀，37 ℃反应90 min。②反应完成之后再加入1 mL的DMSO，得到百草枯活化液待用。③取1 mg AP酶溶解在0.1 mol/L Tris，pH为8.0的缓冲液中，加入600 µL百草枯活化液，反应 30 min。④反应完成之后，加入100 µL 1 mol/L甘氨酸，反应15 min。⑤用蛋白测定仪确定蛋白标记物浓度。⑥用酶标记物稀释液稀释至25 μg/mL。

图2 R2生产工艺流程图

1.3.3 标准液的制备

将百草枯国家标准物（货号：YJ-XXXX）用 0.1 mol/L PH为7.4的PBS缓冲液溶解成1 mg/mL母液；再分别稀释成0 ng/mL、5 ng/mL、25 ng/mL、 125 ng/mL、250 ng/mL及500 ng/mL 6个不同浓度的标准液C1～C6。

2 结果与分析

用6个不同浓度标准液对发光仪进行定标后，分别进行准确性、灵敏度、特异性、精密度以及稳定性分析。

2.1 准确度分析

将1 mL高浓度标准液C5（250 ng/mL）加入到9 mL低浓度标准液C1（0 ng/mL）中，混匀后在化学发光免疫分析仪上测试混合液和低浓度标准液浓度值，各测试3次，计算平均值，回收率应在85%～115%。根据公式（1）计算结果，回收率为99.58%，在要求范围以内。测试数据见表1。

表1 准确度测试数据

式中：R为回收率，%；V为加入高浓度标准液体积，mL；V0为低浓度标准液的体积，mL；C为混合液测试平均值，ng/mL；C0为低浓度标准液测试值，ng/mL；Cs为已知高浓度标准液浓度，ng/mL。

2.2 灵敏度评估

取标准液C1和C2作为待测样本，在化学发光测定仪上对C1进行20次测定，C2测试3次，统计测量结果的发光值（RLU），计算C1的平均值（M）和标准差（Standard Deviation，SD），得出M-2SD；同时根据C1和C2之间的发光值（RLU）进行两点回归拟合得出一次方程，将M-2SD的RLU值代入上述方程中，求出对应的浓度值，即为产品的灵敏度，要求灵敏度不能大于5 ng/mL（国家标准要求最低残留量）。从表2数据可以计算得出，试剂检测灵敏度为0.37 ng/mL，远远小于5 ng/mL，产品具有很高的灵敏度。

表2 灵敏度测试数据

2.3 特异性分析

往试剂盒中滴加干扰物并在化学发光测定仪上分别测定浓度为500 ng/mL的干扰物多菌灵和毒死蜱，各测试3次，测定结果应不得高于0.5 ng/mL。从表3数据可以看出，两组干扰物的测试结果均远远小于0.5 ng/mL，说明试剂盒受干扰物影响很小，具有很高的特异性。

表3 特异性测试数据

2.4 精密度

在化学发光测定仪上分别测定标准液C2和C5，各重复测试至少10次，分别计算测量值的平均值（x—）和标准差（SD）[6]。计算变异系数（Coefficient of Variation，CV），结果应≤8%。由表4可知，标准液C2和C5变异系数均小于8%，产品的精密度 很高。

表4 精密度测试数据

2.5 稳定性评估

将制备好的试剂盒进行37 ℃加速老化7 d后，用化学发光免疫分析仪测试，对测试结果的发光值（RLU）进行对照，数据见表。从表5中统计结果可以看出，实验组的蛋白活性回收率达到了95%以上，说明试剂盒稳定性很好。

表5 稳定性实验结果对照表

3 结论

利用磁微粒化学发光法技术对百草枯6个不同浓度的标准液C1～C6进行检测，通过准确性、灵敏度、特异性、精密度以及稳定性分析，可以得到回收率为99.58%，检测灵敏度为0.37 ng/mL，精密度≤8%，蛋白活性回收率可达到98.17%。