抑毒灵对烟草育苗期TMV的钝化作用

冯永新，谭宏祥，关 辉，靳彦峰，徐 伟，王 杰

（1河北中烟工业有限责任公司原料部，石家庄 530012；2中国农业科学院烟草研究所，山东青岛 266101）

0 引言

烟草漂浮育苗技术已在国内烟叶生产过程中广泛应用。烟草花叶病毒(TMV)引起的病毒病已成为育苗期的主要病害，易通过剪叶等农事操作迅速传播，造成大量移栽苗的隐症带毒，以及移栽后大田花叶病的大面积发生[1]。研究表明，病残体、育苗盘、基质及剪叶工具等是TMV传播的重要初侵染源[2]。目前漂浮育苗过程中消毒措施主要是利用消毒剂对多孔育苗盘、育苗池和剪叶工具进行清洗和消毒。生产上常用消毒药剂很多，主要有含氯化合物、氧化剂和铜制剂等，但消毒方法和消毒效果报道不一，且易造成烟苗药害、环境污染以及工作人员呼吸不适和皮肤灼伤等问题[3-5]。近期研究表明，生物制剂可用于育苗棚、剪叶机械、基质及育苗盘中烟苗残留干叶及干根中的TMV钝化，但生物制剂受有机质的影响较大[6-7]。筛选安全、高效的消毒剂对育苗期TMV的防控具有重要意义。

脱脂牛乳对番茄黄化花叶病毒和烟草花叶病毒均有钝化作用，抑制其复制增殖，并降低病毒的侵染能力[8-9]。此外，脱脂牛乳具有诱导烟草寄主抗TMV的作用[10]。磷酸三钠对TMV和其他病原菌具有较好的杀灭效果，常被用于洗手消毒液、种子处理剂和植物病毒污染工具的消毒剂中，且药液稳定，持效期长，消毒效果不受有机物的影响[11]。本研究系统评价脱脂牛乳和磷酸三钠的复配制剂对基质和剪叶工具中TMV的钝化效果，同时探讨复配制剂对TMV的钝化机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

抑毒灵可湿性粉剂，由脱脂牛奶和磷酸三钠(skimmed milk and trisodium phosphate，SMTP)复配而成，有效成分为10%脱脂牛奶+3%磷酸三钠+0.1%吐温20，由中国农业科学院烟草研究所提供。供试烟草品种为‘枯斑三生烟’和‘K326’，于中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地大棚温室(25～30℃)中光照16 h、黑暗8 h培养培育至7～8叶期，选取健康且生长一致的烟苗供试验用。

TMV毒源由中国农业科学院烟草研究所植物保护中心病毒课题组提供。

供试病毒接种液制备方法：将新鲜TMV病叶按照1:80的比例用0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH 7.2)研磨，双层纱布过滤后获得上清液，备用。对照消毒剂为10%的二氧化氯粉剂（兆冠，潍坊兆冠化工有限公司）。对照抗病毒剂为8%宁南霉素水剂（Ningnanmyein，德强生物股份有限公司）。

剪叶工具为普通剪刀。

1.2 枯斑法测定抑毒灵对TMV的体外钝化作用

采用秦元霞[12]的方法。用无菌水将抑毒灵稀释成500、800、1000倍液，然后将不同浓度的抑毒灵与TMV接种液等量(V/V)混合均匀，室温下分别静置1、3 min后摩擦接种，接种前叶片表面均匀洒适量金刚砂。对照组接种PBS和TMV混合液，每片叶接种混合液300 μL，然后用医用脱脂无菌棉签轻轻擦涂叶片，使混合液均匀分布。接种后10 min喷洒无菌水进行叶面清洗，每个处理3次重复，每次试验重复3遍。接种3天左右后进行枯斑数统计，并计算抑制率。

1.3 抑毒灵对剪叶器具和育苗基质中TMV的钝化作用

1.3.1 抑毒灵对剪叶器具中TMV的钝化作用 参考袁莲莲等[6]的方法。取TMV侵染的新鲜病叶5片，将反复剪切病叶多次的剪刀模拟感染TMV的剪叶器具，然后将污染剪刀在不同浓度的抑毒灵中分别浸泡3、5、10 min，无菌水冲洗2次后进行剪叶，另设PBS缓冲液浸泡的污染剪刀和未污染剪刀为阳性对照和阴性对照。每个处理10株烟苗，每株剪3片烟叶，每个处理重复3次，剪叶后每个处理分开单独培养。30天后统计发病率、病情指数。

1.3.2 抑毒灵对基质中TMV的钝化作用 参考曹毅[5]和袁莲莲[6]的方法。5 g新鲜TMV病叶加入100 mL 0.01 mol/L PBS(pH 7.2)缓冲液研磨成匀浆，4层纱布过滤。然后将稀释500、800、1000倍的抑毒灵和稀释800倍的二氧化氯分别按照1:5(mL:g)比例与TMV滤液混合后浇灌基质，室温静置15天，以此基质种植4叶期‘K326’幼苗。以0.16µg/mL宁南霉素水剂按照1:5(mL:g)比例处理病毒汁液浇灌过的基质为药剂对照，PBS缓冲液处理为空白对照。30天后统计发病率、病情指数，并再采集各处理的基质，依据McGrath等的方法进行离心处理[13]，后利用PowerSoilTMRNA Extraction Kit(MOBIO，USA)进行总RNA提取，提取方法参照试剂和说明书进行操作，每个样品进行3次重复提取。利用real-time RT-PCR测定其TMV相对含量。

1.4 抑毒灵对TMV粒体的影响

TMV病毒粒体的提取参照Gooding[14]的方法。利用透射电镜观察脱脂牛奶和磷酸三钠复配制剂抑毒灵(SMTP)对TMV病毒粒体外观的影响，取100 μL浓度为10 μg/mL的TMV病毒，加入等体积不同浓度的SMTP稀释液旋涡混匀；室温静置20 min。不加SMTP的病毒溶液作为空白对照。

1.5 抑毒灵诱导烟草抗TMV效果测定

1.5.1 抑毒灵诱导烟草防御相关酶活性测定 选用生长健壮且一致的‘K326’烟苗（8～9叶期）进行以下试验处理。阳性对照组(PBS+TMV)为喷施PBS缓冲液+TMV混合液，处理组1（抑毒灵+TMV）为喷施抑毒灵500倍稀释液+TMV混合液，处理组2（宁南霉素+TMV）为喷施宁南霉素800倍稀释液+TMV混合液。各处理10株烟苗，每株烟苗喷施3 mL混合液，每处理重复3次。分别于试验处理后1、3、5、7、9天采集处理叶，液氮速冻后于-80℃保存。

总蛋白含量测定采用BCA(bicinchoninic acid)比色法，具体步骤根据总蛋白定量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）使用说明进行操作。采用比色法测定多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)酶活。根据酶活测试盒（碧云天生物技术有限公司）使用说明测定不同时间点的酶活变化；PAL酶活性以每毫克蛋白每分钟OD290值变化0.01为一个酶活力单位；PPO酶活性以每毫克蛋白每分钟OD420值变化0.01为一个酶活力单位；POD酶活性以每毫克蛋白催化1 μg底物为一个酶活力单位；3个酶活力单位均为U/mg。每处理重复3次。

1.5.2 抑毒灵诱导烟草抗病相关基因分析 烟草总RNA的提取使用超纯RNA提取试剂盒（康为世纪生物科技股份有限公司），使用HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒（康为世纪生物科技股份有限公司）进行逆转录试验，具体操作按试剂盒说明书进行。以β-actin为内参基因，分别以PR1a、PR1b、NPR1、PAL抗病相关基因特异引物进行Real-time RT-PCR（表1），引物由宝生物工程（大连）有限公司(TaKaRa)合成。

表1 诱导烟草抗病性相关基因的qRT-PCR引物

1.6 药害试验

采用曹毅[5]和刘勇[3]的方法。选用160孔泡沫漂浮育苗盘播种育苗，传统漂浮育苗技术操作处理按照中国烟草总公司《烟草漂浮育苗操作规程》进行。第1次剪叶时间为5叶龄，在第4次剪叶烟苗大十字期进行喷药处理。抑毒灵浓度设置为稀释500、800倍，10%的二氧化氯粉剂浓度设置为稀释800、1000倍，每处理2盘，每盘160株烟苗，选择生长健壮一致的烟苗试验。然后采用手持式喷雾器进行药剂喷施，每盘6 mL，至叶面雾滴均匀，无明显液滴流下。以无菌水处理为对照，施药后第7天进行显症株数和药害症状调查，记录无明显侵染性病害症状的不正常现象为药害症状。

1.7 数据分析

所得数据均用Sigmaplot 12.0软件处理，同时利用SPSS(version 14.0)统计软件中单样本t-test对不同处理的差异显著性进行分析。

采用国家标准《病害分级标准》(GB/T 23222—2008)调查各处理的病情指数，烟草病毒病害严重度分级标准，以整株为单位。0级，全株无病；1级，心叶明脉或轻微花叶，病株无明显矮化；3级，1/3叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的3/4以上；5级，1/3～1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高的2/3～3/4；7级，1/2～2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的1/2～2/3；9级，全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的1/2以上[15]。

2 结果与分析

2.1 抑毒灵对TMV的钝化作用

从表2、图1结果可知，抑毒灵稀释液对TMV的钝化作用表现出时间和浓度依赖性，且呈正相关。抑毒灵与TMV接种液混合1 min后的接种叶片枯斑数均较对照显著减少，浓度越高，抑制效果越好，对TMV抑制率分别为500倍99.08%、800倍75.60%、1000倍69.62%，而混合3 min的处理中TMV的抑制率分别为100.00%、86.71%、74.89%，且不同处理间抑制率差异显著。采用500倍抑毒灵消毒1 min以上时间抑制效果最佳。

图1 不同稀释倍数的抑毒灵对TMV的钝化作用

表2 不同浓度抑毒灵(SMTP)对TMV体外钝化作用

2.2 抑毒灵对剪叶器具上TMV的钝化效果

从表3得知，不同时间的PBS处理中TMV发病率约35.62%、35.65%和35.79%，而不同浓度的抑毒灵处理中TMV发病率为0%～15.66%，相对防效为51.42%～100.00%，显著抑制了剪叶器具上TMV对幼苗的侵染，其中500倍抑毒灵稀释液处理剪叶器具3 min时，TMV发病率为6.35%，相对防效达到77.30%。随着抑毒灵处理浓度升高，处理时间延长，TMV发病率显著下降，防治效果明显增加，且不同浓度的抑毒灵处理间发病率和相对防效差异显著。剪叶器具经稀释500倍的抑毒灵浸泡不少于5 min时对TMV的钝化效果可达100%。而800倍二氧化氯稀释液处理剪叶器TMV发病率和相对防效与800倍抑毒灵稀释液处理组表现无显著差异。

表3 抑毒灵对剪叶器具中TMV的钝化效果

2.3 抑毒灵对基质中TMV的钝化效果

由表4可看出，与空白对照相比，经不同浓度的抑毒灵处理基质中TMV含量显著降低，且不同浓度的抑毒灵处理的基质中TMV拷贝数差异显著，其中500倍抑毒灵处理最低（2506.49个/g），为空白对照的9.73%，对照药剂宁南霉素的44.96%。随着抑毒灵浓度的升高，TMV的发病率显著下降，防效明显增强，相对防效达54.83%～85.45%，其中800倍抑毒灵处理基质中TMV发病率比宁南霉素处理组略低，相对防效在70%左右，无显著差异，而不同浓度的抑毒灵处理组间TMV发病率和相对防效均表现出差异显著性。由此可知，抑毒灵可明显钝化育苗基质中TMV，抑制其复制增殖，进而降低发病率，500倍抑毒灵对TMV的钝化作用最佳。

表4 抑毒灵对基质中TMV的钝化作用

2.4 抑毒灵处理对烟苗的药害情况

抑毒灵稀释500倍和800倍液喷施不会对烟苗造成药害，而10%的二氧化氯粉剂稀释800倍和1000倍液喷施会对烟苗造成轻微药害，药害率分别为4.9%和2.6%（表5）。

表5 抑毒灵处理烟苗的药害情况

2.5 不同浓度SMTP对TMV病毒粒体的影响

由图2可知，未经SMTP溶液处理的病毒粒体长条柱状，比较集中，完整；经1000倍液处理的TMV病毒粒体，部分TMV粒体外部出现裂痕，粒体长条柱状仍然较完整；与500倍SMTP液共孵育后，病毒粒体断裂成微小片段，表面受损严重，基本消损完。经800倍SMTP液处理后，粒体长条柱状断裂成段，表面裂痕增加，部分TMV粒体上出现多条裂痕。

图2 常温下不同浓度SMTP溶液处理20 min的病毒粒体透射电镜图像

2.6 抑毒灵诱导烟草防御酶活性

由图3可知，在处理1～9天后，抑毒灵+TMV处理组防御酶活性变化趋势有较大差异。与PBS+TMV处理组相比，抑毒灵可提高防御酶PPO和PAL的酶活，PPO酶活在第1天达到最大值，PAL酶活在第3天达到最大值，随后保持相对稳定；而β-1,3葡聚糖和POD的酶活呈现下降趋势，与PBS+TMV组比，显著降低(P＜0.05)；喷施宁南霉素+TMV对烟草POD活性有提高作用，与对照组和抑毒灵+TMV处理组相比，差异显著(P＜0.05)。

图3 抑毒灵处理烟草防御酶活性

2.7 抑毒灵提高烟草抗性相关基因转录水平

抑毒灵+TMV组可显著诱导防御基因NPR1、PAL、PR1b和PR1a的表达。其中，NPR1在抑毒灵处理1天后就高诱导表达，其相对表达量表现出先升高后下降的趋势，但总体高于对照组的表达量，而宁南霉素处理组与对照组基因表达量差异不显著。在抑毒灵+TMV处理第3天时PAL基因相对表达量达到最高，而其他处理时间，处理组与对照无明显差异。PR1b在抑毒灵处理1天后表达量增加显著，但在第3天表达量与对照组和宁南霉素组无差异，随后表达量显著上升。PR1a相对表达量随着时间的增加升高，在处理后第5天时，表达量达到最高，同时宁南霉素处理组PR1a基因的表达量在第1、3天显著高于对照组和抑毒灵组（图4）。

图4 抑毒灵诱导烟草防御基因表达相对量

3 结论

抑毒灵对烟草漂浮育苗中TMV的钝化效果显著，与其他化学抗病毒制剂或消毒剂相比，具有直接作用于病毒粒体和诱导寄主获得抗性的能力，且安全、高效、持续，对植物病毒病的防治有潜在的应用价值。但是为了进一步明确抑毒灵对TMV的灭活和钝化作用，需对其田间抗病毒病发生效果进一步观测。

4 讨论

烟草育苗期极易受TMV侵染，且TMV在不同物体表面（鞋底、轮胎、金属和塑料表面）可存活多周，在病残体内存活更久，仍具有强侵染力[1-2]。另外，烟苗一旦被侵染会造成田间病毒病的大面积传播和严重危害。因此育苗过程中初侵染源的消毒措施和消毒药剂的选择至关重要。前期研究表明，旧苗盘、剪叶机上病苗残留物为育苗期烟苗的初侵染源，是烟草团棵期部分田块TMV发病率高于20%的主要因素[1]。为此，本研究选用对TMV具有显著钝化作用的加0.1%吐温20的脱脂牛乳和磷酸三钠的混配制剂为研究对象，通过枯斑法测定抑毒灵对烟草漂浮育苗过程中被TMV污染的基质及剪叶器的钝化作用。同时笔者利用透射电镜观察抑毒灵对病毒粒体的影响，并采用实时qPCR对TMV含量以及寄主防御蛋白相对表达量进行定量检测，对消毒剂的钝化机制进行了分析，为烟草漂浮育苗过程中烟草病毒病的生物消毒剂提供应用和理论数据支撑。

适用于温室育苗的消毒剂通常具有接触时间短，对病毒和类病毒甚至其他植物病原体有灭活作用，对工人安全，对基础设施和工具无腐蚀性，对植物无毒性且经济等特点。曹毅等[5]研究发现，中性消毒粉剂50倍稀释液处理5 min可完全钝化病叶汁液中以及病苗风干的细侧根和叶片细条中的病毒，而二氧化氯粉剂和聚维酮碘水溶剂50倍稀释液需处理20 min才可以完全钝化病叶汁液中和病苗风干的细侧根和叶片细条中的病毒。但中性消毒粉剂和二氧化氯粉剂易产生药害，症状主要表现为退绿斑点、坏死和叶片畸形。刘勇等[3-4]通过三抗体夹心法和TMV试纸条检测发现，98%磷酸三钠25 g/L和50 g/L溶液、2%二氧化氯10 g/L溶液、7%有效氯次氯酸钠10 g/L溶液、高锰酸钾3.3 g/L溶液和30%有效氯漂白粉50 g/L浸湿旧苗盘3 min后塑料膜覆盖2～3天可使病苗干根中的TMV彻底失活。Lewandowski等[11]通过TMV-杂交矮牵牛筛选系统对13种消毒剂对TMV污染的剪叶工具传毒的抑制效果进行了系统研究，结果发现20%的脱脂牛乳和0.6%次氯酸钠10倍稀释液均可完全抑制剪叶工具中TMV对杂交矮牵牛的系统侵染。此外，脱脂牛乳对建兰花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、番茄褪绿矮缩类病毒和马铃薯Y病毒系等也有较强的钝化作用，但对凤果花叶病毒、番茄花叶病毒的侵染抑制效果不理想[16-19]。本研究中抑毒灵可在1 min内对TMV接种液起到灭活作用，3 min内可完全抑制剪叶器具和育苗基质中TMV对烟苗的侵染，与上述研究报道中的消毒剂比较，抑毒灵对基质和剪刀中TMV的抑制和钝化作用更强、更高效（作用时间短）。而且抑毒灵500倍稀释液比二氧化氯溶液对植物和工人更安全[5,9]。

虽然针对不同的病毒侵染寄主的模式，已开展了大量消毒剂的病毒钝化活性筛选，但对于消毒剂抑毒机理并未见报道。前期研究发现黏质沙雷氏菌产生的灵菌红素、宁南霉素和嘧肽霉素均可通过破坏TMV病毒的四聚体外壳蛋白结构，引起病毒粒体的断裂，达到破坏病毒的作用[21-22]。本研究表明经SMTP500倍液共孵育后的病毒粒体断裂成微小片段，外壳蛋白受损严重，螺旋结构和柱状基本消损完全，与前人研究结果表现一致。然而从病毒结构组成分析，病毒由外壳蛋白和携带遗传信息的核酸组成[20]，抗病毒制剂引起病毒粒体断裂的靶标对象是外壳蛋白或核酸需在分子和蛋白层面深入探析。除此之外，宁南霉素和嘧肽霉素作植物免疫诱抗剂在病毒侵染前使用均可诱导PR蛋白的表达，提高寄主的抗病毒能力[20,23-24]，而SMTP作为消毒剂使用，通过防御酶PPO和PAL酶活的显著提高，以及防御基因NPR1、PAL、PR1b和PR1a的表达量显著增加，也能达到抑制病毒侵染的目的，该发现为首次报道。综上，SMTP可通过直接作用于病毒粒体和诱导烟草抗性起到钝化TMV侵染效果。但SMTP是否适用于其他病毒侵染寄主测试系统，如番茄-番茄黄化花叶病毒、黄瓜-西葫芦黄花叶病毒等，需进一步验证。