以分子工具为钥，解肠道菌群之密

李文博

肠道菌群是近年来微生物学、医学、基因组学等领域引人关注的研究焦点。

人自出生后，外界的微生物就会逐渐进入人体。在正常情况下，人体和共生菌群之间，以及共生菌群各细菌之间，会保持一定的生态平衡，如果平衡失调，就有可能导致疾病的发生。其中，人体肠道内有数万亿个细菌与人类共生，它们广泛参与和影响人体的代谢活动、抵御感染和自体免疫疾病的患病风险，还能控制人体对一些癌症治疗药物的反应。但因为基于脱氧核糖核酸（DNA）测序、细菌分离培养、基因工程等方法的传统研究思路在菌群复杂功能的深入研究中存在一些技术瓶颈，关于肠道菌群仍有诸多悬而未解的难题。

针对这一系列问题，上海交通大学医学院副研究员王炜认为：化学的研究工具和思路有巨大的應用空间和科学价值。他自博士阶段即致力于针对与人类健康密切相关的复杂细菌体系开发新的化学研究工具与方法，竭尽全力，除人类之病痛，助健康之完美。

心怀向往 坚持不懈

王炜的母亲是一位药剂师，由于父母工作的原因，他自幼便生活在基层医院的大院环境中。在王炜的感受中，医院是温情的。这里承载着他美好的童年，给予了他最初对医生这一职业的美好向往。

2003年，非典暴发，彼时是王炜进入山东大学医学院临床医学专业学习的第二个年头。这是他亲身经历过的第一件关乎全人类生命健康安全的大事件，医护人员在此时发挥的作用、作出的巨大贡献、展现出的希波克拉底精神，使王炜产生了一种朦胧但强烈的责任感和使命感，自此加倍努力，精益求精。

“救死扶伤”是王炜给自己定下的终身目标，但他却并未在毕业后顺势成为一名临床医生，反而辗转万里到美国密苏里大学，拜入生物化学系托马斯·马维尼（Thomas Mawhinney）教授的门下。他是这样回答面试问题的：“我希望能学一门新的知识，结合我的医学教育背景，将来可以做些不一样的，并且能真真切切帮助到广大病人的研究。”事实上，当时马维尼教授已年逾70，早已数年不再招收新的学生，却还是为了这样一名心系人类健康的淳朴学子而破例，招录了王炜。

在美国密苏里大学生物化学系学习和研究的6年，王炜打下了坚实的科研基础，丰富了与临床医生的合作经验，加深了对临床病症的认识和对医学事业的热爱与执着，这在很大程度上要归功于他的导师。跟随导师进行科学研究的日子里，王炜开始致力于针对细菌生物膜研究开发新的化学探针，几乎没有化学和微生物研究背景的他经过几年努力，逐渐取得了长足进步：“在实验室锻炼几年以后，我开始敢于尝试分子工具设计，独立进行探针分子合成了。”按照王炜自己的话来说，这种“不怕犯错，不惧失败，敢闯敢拼”的精神是他在博士时期最重要的收获之一。

在这一时期，王炜跟随导师的步调，将囊性纤维化（cystic fibrosis）导致的肺部长期感染作为主要研究对象。这是一种涉及细菌感染的高致死率疾病，也是高加索人种之中最常见的遗传性疾病之一。王炜也曾好奇过：导师为什么选择这样一种疾病作为研究对象呢？他是从旁人的只言片语中，逐渐拼凑出了导师研究经历：一位法医病理学出身的年轻医者，因为解剖研究了大量死于囊性纤维化的儿童尸体而立志探究其致病原理，寻找医治方法;自学合成化学，一手组建微生物和化学的交叉学科实验室，在黑暗中摸索着前行，从青丝满头到鬓边斑白……

与导师一同在实验室和临床忙碌时，王炜也能从导师与病人接触的点点滴滴中深刻感受到导师对病人的关切：“每周的教学工作要花去四十几个小时，他就在额外的时间里来做基础研究，不止对患者进行精心治疗，对患者家属也照顾得十分周到。”这位老者总是在尽最大可能减少患者和患者家属的痛苦，他的坚持、信念自然也对王炜产生了深刻的影响。每当心有迷茫，王炜总会想起非典时期自己沸腾的热血和那难以言说的感动，也会想起导师的谆谆教诲和伟大的医者情怀。这些回忆即便不能帮助他攻关克难，但总能激起他一往无前的勇气与决心。

目标明确 奋力前行

自从在本科阶段真正树立了从医理想后，王炜几乎所有关于科研的重要选择都带有明确的目的：前往美国密苏里大学是为了寻找更适合他的发展道路，完成“即使不在临床也能救人”的心愿;前往北京大学是为了学习更多的分子探针技术以用于微生物学的研究;前往上海交通大学医学院是为了继续基础研究的同时能够和临床医学问题密切结合。

事实上，博士毕业回国并加入北京大学陈兴教授课题组进行化学生物学的博士后研究后，即便得到了来自陈兴教授与团队的大力指导与帮助，王炜也会时常感到困惑。这是因为当时陈兴教授课题组以真核细胞为主要研究对象，而王炜则正因囊性纤维化是白种人特有疾病而面临方向转变之困。经历了一段艰难的学习与摸索之后，他才最终探索出化学探针与肠道菌群相结合的研究方向。

2017年，王炜面临博士后出站问题，但此时此刻他已完全沉浸在新的研究方向之中，渴望进行更进一步的探索，因此主动请求延迟一年出站。一年过去，王炜手头的研究还未完成，但恰好此时上海交通大学医学院分子医学研究院正在筹备成立，研究院的杨朝勇副院长向王炜递去了橄榄枝。“这应该是国内首个把化学科研机构直接设置在医院的研究所。这一方面是我感兴趣的科研方向，一方面又圆了我少年时的医生梦想。”得益于前期的沉淀与杨朝勇教授和团队的大力支持，加入上海交通大学医学院分子医学研究院后，王炜迎来了科研成果的井喷期。

通过发展活体实时以及原位三维成像，解决了肠道菌群难以在体观测的问题;通过活体中的荧光D型氨基酸（fluorescent D-amino acid，FDAA）探针标记加荧光原位杂交（FISH）联用策略，实现了细菌肠道内生长分裂方式的成像观察和生长活性的直接定量……在面向肠道菌群进行研究的过程中，王炜深刻体会到分子工具与化学研究策略在这一极为复杂的微生物体系中的应用价值与潜力，因为有了“武器”和策略才有“战斗”的资本。

刻苦钻研 孜孜不倦

“菌群在宿主肠道中的微观分布可直接影响其生理病理功能”这一认识在近年来逐渐为人们所了解和认可，但菌群在肠道黏膜表面的三维分布是怎样的？菌群不同的分布会导致哪些对应的结果？影响菌群分布的因素有哪些……一系列问题仍旧是未解之谜。要想解开这些谜题，科研人员必须先扫除来自观察方面的重重障碍：到目前为止，由于肠道菌群生活环境较为特殊，且在这一构成高度复杂的微生物体系（300～500种细菌）中，包含着数目惊人的各类基因（500万～1000万）和极为繁复的生物、化学反应过程，大部分肠道细菌仍不能在体外单独培养，这导致科研人员无法在实验室对其进行研究;严重缺乏菌群成像的工具和手段，导致对肠道菌群的研究难以做到“眼见为实”;分析菌群组成的动态变化时仅可依靠脱氧核糖核酸测序等间接手段，缺少可对细菌在肠道内的生长活性进行直接判定的方法……

针对移植到小鼠体内的外源菌群无法活体实时成像追踪这一痛点，王炜与合作者利用D型炔丙基甘氨酸（D-propargylglycine）探针灌胃对小鼠菌群进行原位代谢标记，进而可通过点击化学反应将筛选后的近红外Ⅱ区（NIR-Ⅱ）小分子荧光染料共价偶联到细菌表面。这一方法回避了肠道细菌的体外培养，得到的带有近红外Ⅱ区荧光的菌群在保证活性的同时仍可保持完整的组成结构。以此作为供体菌群移植给受体小鼠后，通过铟镓砷电荷耦合元件（CCD）探测器即可实现活体、无创的菌群实时成像追踪。

针对固有菌群与宿主肠道微结构的相对空间关系无法进行三维成像研究这一瓶颈，王炜与合作者开发了经腹腔注射荧光D型氨基酸的肠道菌群在体标记新方法。探针在经胆汁分泌进入肠道进而高效标记菌群的同时，也可使宿主组织的荧光吸附背景大为减弱。通过结合组织透明化（tissue clearing）策略，他们首次实现了肠道固有菌群的原位、三维、单细菌分辨率荧光成像，能够为进一步理解肠道菌群的生理功能以及宿主和菌群在不同条件下的相互作用提供独特的研究工具和视角。

针对肠道菌群中大部分细菌仍无法进行体外单独培养、难以进行细胞生物学研究的问题，王炜先是实现了对小鼠大部分肠道细菌的双色序贯荧光标记，继而通过对这一菌群中不同种属细菌分别进行荧光原位杂交染色以实现对所感兴趣种类细菌进行直接的成像观察。这一研究策略巧妙地避免了细菌体外培养，利用细菌在肠道内原位的生长过程使其带上具有时序信息的双色标记，配合荧光原位杂交染色所提供的物种信息，可以高效、方便、準确地获得各类肠道细菌在体内的生长分裂模式信息。利用这一方法，他和团队成功地对70多个种、属细菌的生长分裂情况进行了高分辨荧光成像分析，其中包括了多个从未在体外进行过单独培养和研究的物种，由此得以窥见这些神秘细菌的“庐山真面目”。同时，也针对与宿主免疫系统有密切相互作用的分节丝状菌（segmented filamentous bacteria，SFB）在宿主肠道内的不同生长分化阶段进行了细致的成像分析。作为首个可对肠道中的这部分“暗物质”进行细胞生物学研究的方法，这一研究策略将会为直观观察并深入理解各类肠道细菌在宿主体内的微生物活动提供全新的研究角度。

在目前的菌群研究中，往往是通过脱氧核糖核酸测序得出的不同时间点各类细菌相对丰度的变化，来推测相应细菌的体内活性变化，这导致了无法直观、准确地对细菌的生长代谢活性进行定量的问题。王炜先是推测并通过严谨的实验证明了荧光D型氨基酸对体内细菌的标记强度与细菌生长代谢速度具有很高的正相关性，其后结合荧光原位杂交所得到的细菌种属信息，成功地通过流式细胞分析定量测得不同细菌在肠道内的生长代谢水平。据此，他开发了首个能够直观、准确地对各类细菌在肠道中的生长代谢状态进行定量研究的化学生物学方法，为真正揭示菌群在体内受各种内外源因素影响时的动态变化情况提供了有力的技术支撑。受这一细菌活性定量方法的启发，最近王炜又和上海交通大学医学院附属仁济医院的临床医生合作，将这一新方法应用到病原菌的快速抗生素药敏检测之中。通过流式细胞仪分析肺泡灌洗液等临床样品中的病原菌在受不同抗生素影响时的代谢活性变化趋势，可以快速、准确地给出药物敏感性信息。这一新方法在国际上首次解决了临床获得性肺炎病人诊断用药耗时长而导致病死率高这一难题。

随着研究的不断推进，王炜所发展的这一独立于传统测序手段的菌群研究新方法，也越来越为国内国际领域同行所关注和认可。2022年，王炜关于肠道菌群化学生物学的研究正式获批立项，他将在为期3年的研究时间里着重开发选择性菌群在体标记探针，发展基于各类化学工具的菌群研究新平台与成像新方法，并通过这些新工具对不同内外源因素如何影响各类肠道细菌的生长代谢状态、菌群移位到肠外器官的过程和活性的变化情况等重要科学问题开展研究。他期待着开拓化学工具在肠道菌群研究中的进一步应用，为深入理解这一重要微生物体系提供新的化学生物学解决方案。

走过十几年科研探索的风雨之路，历经无数次研究失败与成功之后，王炜依旧牢记并践行着曾经的庄重誓言——献身医学，刻苦钻研，孜孜不倦。

（责编：袁园）