鳖甲煎丸含药血清对肝癌干细胞的抑制作用及潜在调控机制研究

谢杨益，林洪升，孔茵芝，潘爱萍，李明芬*

（1.广西中医药大学，南宁 530200；2.广西中医药大学第一临床医学院，南宁 530021；3.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530021）

肝癌是全球第四大癌症相关死亡原因，发病率呈不断上升趋势[1-2]。到2025 年，每年将有超过100 万人受到肝癌的影响[3]。目前，手术切除和肝移植是治疗早期肿瘤最有效的方法。肝癌起病隐匿，肿瘤进展迅速，大多数肝癌患者在确诊时为中晚期，失去手术根治性治疗的机会。肝癌的五年总生存率仅为30%～40%[4]。肿瘤干细胞具有自我更新、分化和产生新肿瘤的能力[5]。肝癌干细胞的存在与肝癌的发生、进展、复发和耐药密切相关[6]。中药能通过多机制和多层面抑制肝癌的发展。研究[7]发现，肝癌干细胞是中医药治疗肝癌的重要靶点。鳖甲煎丸出自汉代名医张仲景的《金匮要略》，现多应用于肝纤维化、肝硬化、肝炎、肝癌等肝病治疗中，疗效显著[8]。本课题组的前期实验也发现，鳖甲煎丸可抑制肝癌细胞增殖[9]，但对于肝癌干细胞的研究尚未见报道。本研究通过免疫磁珠分选肝癌干细胞，制备鳖甲煎丸含药血清干预肝癌干细胞，分析信使RNA（messenger RNA，mRNA）表达谱变化，进一步探讨鳖甲煎丸治疗肝癌的作用机制，以期为针对肝癌干细胞的靶向治疗提供新思路。

1 实验材料

1.1 实验细胞 人肝癌细胞株SMMC-7721，受赠于广西中医药大学生化教研室。

1.2 实验动物 SPF 级SD 雄性大鼠，购于广西医科大学动物实验中心，体质量（201.38±17.57）g，生产许可证号：SYXK（桂）2013-0005。所有操作都在国家实验动物使用标准和伦理要求下进行。

1.3 实验药品 鳖甲煎丸，购于武汉中联药业集团股份有限公司，国药准字Z42020772。

1.4 实验试剂 胎牛血清，美国Gbico 公司；DMEM细胞培养基，美国Gbico公司；CCK-8试剂盒，日本同仁公司；免疫磁珠分选系统，德国Miltenyi公司；人CD133-PE 流式抗体，德国Miltenyi 公司；细胞总RNA 提取试剂盒RNeasy Mini Kit，德国Qiagen 公司。

2 方法

2.1 细胞培养 采用含10%胎牛血清的DMEM 培养基，将细胞置于37 ℃、5% CO2条件下静置培养。

2.2 鳖甲煎丸含药血清及空白对照血清制备 用生理盐水将鳖甲煎丸溶解配制成混悬液，鳖甲煎丸成人临床剂量为3 g/60 kg，大鼠给药剂量按成人剂量20 倍配制为1 g/kg。大鼠适应性饲养7 d 后，按10 mL/kg灌胃给药，分别予等量鳖甲煎丸混悬液和生理盐水灌胃，每天2 次，连续3 d。第4 天给药2 h 后，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，静置2 h 以上，4 ℃条件下3 000 r/min 离心15 min，分离并混合同组血清。将血清置于56 ℃水浴箱中灭活30 min 后，再使用0.45 μm 和0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，获得鳖甲煎丸含药血清及空白对照血清，置于-20 ℃冻存[10]。

2.3 免疫磁珠分选CD133+细胞群 收集1×107个细胞，重悬于100 μL 缓冲液中。向细胞悬液中加入20 μL CD133 抗体和10 μL 免疫磁珠，轻轻混匀后，4 ℃避光孵育15 min。离心洗涤细胞后用500 μL 缓冲液重悬，加到分选柱上，滤过细胞悬液，再加入500 μL 缓冲液将分选柱洗2 遍。从磁场中取出分选柱，加入1 mL缓冲液，收集此次细胞悬液，即为CD133+细胞。

2.4 流式细胞术检测细胞CD133 表达 收集细胞，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤后重悬，调整细胞密度为每毫升1×106个。每管加入100 μL 细胞悬液，再向管中加入5 μL 人CD133-PE 流式抗体，混匀，室温避光孵育10 min。加入PBS 至500 μL，轻轻混匀，用流式细胞仪检测。

2.5 CCK-8 法检测细胞增殖能力 在96 孔板中每孔加入100 μL 浓度为每毫升2×104个的细胞悬液，每组设3个复孔，在培养箱中预培养24 h。给培养板换液（含10%胎牛血清或鳖甲煎丸含药血清或空白对照血清的DMEM 培养基），在培养箱中培养24、48、72、96 h。向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在培养箱中培养2 h，用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度（OD）。

2.6 Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭能力 取对数生长期的细胞，PBS 洗涤，调整细胞密度为每毫升1×106个用无血清培养基重悬。取600 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培养基加入24 孔板下室，将Transwell小室置于24 孔板内，分别在上室中加入100 μL 细胞悬液，放入培养箱中培养24 h。取出小室，弃去培养基，将小室用PBS 洗2 遍后，4%多聚甲醛固定30 min，然后用0.1%结晶紫染色10 min，PBS 洗2 遍后风干，在高倍显微镜下选取5 个视野观察细胞并计数。

2.7 总RNA 收集 将细胞用含10%鳖甲煎丸含药血清或空白对照血清的DMEM 培养基培养24 h，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，检测RNA 样品的浓度和纯度。

2.8 差异表达mRNA 分析 全细胞转录组分析由深圳海一时代基因有限公司完成，测序平台为Hiseq 2500 SE 50。通过DEGseq 差异分析软件，以差异倍数≥2和P-value≤0.05 的条件筛选差异表达的mRNA。

2.9 生存分析 Kaplan-Meier Plotter 数据库将GEO、EGA 和TCGA 数据库中患者的基因表达数据和生存信息进行整合，评估常见肿瘤患者中各种基因表达水平与临床结果的相关性[11]。使用 Kaplan-Meier Plotter 数据库评估Wnt 信号通路相关差异mRNA 在肝癌中的预后价值。

2.10 统计学方法 实验数据应用SPSS 20.0 软件，采用独立样本t检验进行统计学处理，以均数±标准差（）表示。所有实验重复3 次。

3 结果

3.1 肝癌干细胞的分离与鉴定 通过免疫磁珠法分选出CD133+肝癌干细胞进行培养，采用流式细胞术检测CD133 表达。与肝癌细胞比较，肝癌干细胞中CD133+细胞所占比例明显增高，达到86.6%，见图1。采用CCK-8 法检测肝癌干细胞的增殖能力，Transwell 侵袭实验检测肝癌干细胞的侵袭能力，结果显示肝癌干细胞的增殖和侵袭能力均明显提高，见图2，图3。

图1 肝癌细胞与肝癌干细胞的CD133 表达比较

图2 肝癌细胞与肝癌干细胞的增殖能力比较

图3 肝癌细胞与肝癌干细胞的侵袭能力比较

3.2 鳖甲煎丸含药血清对肝癌干细胞增殖能力的影响 肝癌干细胞经鳖甲煎丸含药血清干预后进行CCK-8 实验，发现细胞增殖能力明显受抑制，与空白对照血清组比较差异有统计学意义，见图4。

图4 鳖甲煎丸含药血清对肝癌干细胞增殖能力的影响比较

3.3 差异表达mRNA 分析 对鳖甲煎丸含药血清和空白对照血清2 组样品进行mRNA 差异分析，发现部分差异mRNA 属于Wnt 信号通路，包括Wnt 家庭成员1（WNT1）、鸟苷酸结合蛋白1（GBP1）、连环蛋白β1（CTNNB1）、VANGL 平面细胞极性蛋白2（VANGL2）、刺细胞平面细胞极性蛋白1（PRICKLE1）和丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）。与空白对照血清组相比，这些基因在鳖甲煎丸含药血清组中均表达下调。

3.4 Wnt 信号通路相关差异mRNA 生存分析 通过Kaplan-Meier Plotter 数据库评估Wnt 信号通路相关差异mRNA 表达与肝癌患者预后的相关性，结果显示，WNT1、GBP1、PRICKLE1 高表达组的总生存期明显短于低表达组（P＜0.05），CTNNB1、VANGL2、MAPK8 表达与肝癌患者预后的相关性无统计学意义（P＞0.05），见图5。

图5 Wnt 信号通路相关差异mRNA 表达和肝癌患者总生存期的关系

4 讨论

肿瘤干细胞能够使肿瘤细胞自我更新，维持细胞增殖[12-14]。研究[15-17]表明，肿瘤干细胞是肿瘤复发、转移和耐药的关键因素之一。许多细胞表面蛋白，如CD133、CD44、上皮细胞黏附分子与CD90，已被确定为肝癌干细胞可靠的生物标志物[18-20]。CD133 在维持肝癌干性中起着关键作用。研究[21]表明，从Huh7细胞株中分离的CD133+细胞显示出更高的增殖和致瘤能力。CD133+细胞群有助于肝癌的化学抗性和放射抗性[22]。本课题组通过免疫磁珠法分选出CD133+肝癌干细胞进行培养，并采用流式细胞术检测细胞CD133 表达，采用CCK-8 法和Transwell 侵袭实验检测肝癌干细胞的增殖和侵袭能力。结果显示，分选出的肝癌干细胞中CD133+细胞所占比例达到86.6%，且肝癌干细胞的增殖和侵袭能力较肝癌细胞均明显提高，可用于后续实验。

为了检测鳖甲煎丸对肝癌干细胞生长的抑制作用，本研究采用CCK-8 法检测用含10%鳖甲煎丸含药血清的DMEM 培养基培养，对肝癌干细胞增殖的影响。结果发现，细胞增殖能力明显受抑制，与空白对照血清组对比，差异有统计学意义，验证了鳖甲煎丸对肝癌的有效治疗作用。为了进一步明确其作用具体机制，本研究进行转录组学分析，发现鳖甲煎丸含药血清干预肝癌干细胞后，部分差异表达mRNA 属于Wnt信号通路，包括WNT1、GBP1、CTNNB1、STBM、PRICKLE1 和JNK，提示Wnt 信号通路可能参与鳖甲煎丸对肝癌干细胞的抑制作用。

突变诱导的Wnt/β-catenin 信号激活是人类肿瘤中常见的驱动事件，持续的Wnt/β-catenin 途径激活赋予肿瘤细胞自我更新生长特性，并与治疗耐药性相关[23]。多项研究表明，Wnt 通路在肝癌进展中扮演重要角色，Wnt/β-catenin 信号通路的关键信号分子异常激活，可促进肝细胞的恶性转化、肝癌转移与耐药以及肝癌干细胞的自我更新[24]。研究[25]发现，蛋白酪氨酸激酶2 通过激活Wnt 信号增强肝癌干细胞性状，导致肿瘤复发和索拉非尼耐药。ATP-柠檬酸裂解酶通过影响β-catenin 的稳定性调节Wnt 信号通路，促进肝癌细胞的干性特征、迁移和侵袭能力[26]。鳖甲煎丸抑制肝癌干细胞增殖的药理作用，可能与其下调Wnt信号通路分子的表达水平有关。对Wnt 信号通路相关差异mRNA 进行生存分析发现，WNT1、GBP1、PRICKLE1 高表达组的肝癌患者总生存期明显短于低表达组，提示这3 个基因可能在肝癌发生发展中发挥了重要的作用，是潜在的肝癌预后生物标志物和治疗靶标。

综上所述，本研究证实，鳖甲煎丸能够抑制肝癌干细胞增殖，其抑制作用可能与下调Wnt 信号通路分子的表达水平有关。今后将结合体内实验进一步验证，为阐明鳖甲煎丸的抗肝癌效应及其药理作用提供实验依据。