杭州芦笋茎枯病病原鉴定与防治

石延霞 李宝聚* 王 朵 张旭娟 施建军 路雅静 谢学文 柴阿丽 李 磊

（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 杭州佳惠农业开发有限公司，浙江杭州 311200）

芦笋（L.）也称石刁柏、龙须菜，素有“蔬菜之王”的美誉，是世界十大名菜之一，我国是世界上芦笋第一大生产国和出口国。随着芦笋种植面积的扩大，土传病害发生率亦逐渐上升，常见的病害有茎枯病〔（Sacc.）Bubak〕、枯 萎 病（）、根腐病（spp.）等，可种传、种苗传或者土传（张岳平 等，2012），尤其芦笋茎枯病（asparagus stem blight）是一种全球性的毁灭性病害，在中国、日本、泰国等国家均有发生（Sonoda et al.，1997；Shanmugam et al.，2001；Zhang et al.，2017）。我国由于气候原因芦笋茎枯病普遍发生，3 年以上的芦笋发病率几乎达100%，且南方比北方发生率高（Yang et al.，2016）。近年来，尤其浙江、江苏等地芦笋种植区茎枯病发生严重，一旦染病，植株迅速死亡，降低了芦笋的品质和产量，给当地农业生产带来巨大的损失，严重影响了出口创汇。

芦笋茎枯病最适发病温度为23～26 ℃，病原菌分生孢子器遇水后释放分生孢子，随着风雨等扩散传播，因此多雨、高湿环境更利于该病害的发生和流行（苗华民 等，1991；贾廷祥 等，1992）。2018 年以来，浙江省杭州市佳慧芦笋种植基地茎枯病发生日趋严重，与当地气候条件和未及时采取防控措施，错过了最佳防治时期有关。目前防治该病害的主要手段仍然是化学药剂防治，本试验对杭州芦笋茎枯病病原菌进行鉴定，探究不同药剂对其防治效果，以利于合理用药，有效防控芦笋茎枯病。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

2018 年10 月至2020 年10 月，在浙江杭州佳慧芦笋种植基地采集具有明显发病症状的芦笋茎秆，带回实验室进行致病菌分离，共分离得到病原菌15 株，编号依次为LS18102101、LS18102103、LS18102104、LS18102106、LS18102108、LS18102109、LS18102110、LS18102113、LS18102115、LS18102116、LS18102123、LS18102124、LS18102125、LS18102126、LS18102136。

1.2 试验方法

1.2.1 芦笋茎枯病病原菌的分离、纯化 选取病症发生明显的芦笋茎部，在病健交界处切取大小约5 mm × 5 mm 的茎部组织，用75%酒精消毒30 s，置于无菌水中清洗3 次；晾干后置于PDA 培养基上，于27 ℃培养箱内培养。3 d 后在无菌环境下挑取新长出的菌落边缘菌丝，移至新的PDA 培养基上进行多次纯化培养，直至菌落无杂菌。

1.2.2 芦笋茎枯病病原菌的形态学观察 将纯化后的病原菌转接至新的PDA 培养基上，25 ℃恒温条件下培养7 d 后，观察菌落形态及颜色等特征。待10 d 后病原菌产生分生孢子器，用接种环轻轻刮拭培养基分生孢子器表面制片，在显微镜下观察分生孢子形态、颜色等特征。

1.2.3 芦笋茎枯病病原菌的分子生物学鉴定 利用真菌DNA 提取试剂盒（北京酷来搏科技有限公司），在分离出的15 株病原菌中，随机选取8 株提取病原菌DNA，分别采用真菌通用引物ITS1/ITS4（White et al.，1990）和特异性引物SF/SR（杜宜新 等，2018）对病原菌DNA 进行PCR 扩增。PCR反应体系（50 μL）为：2 ×Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）26 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物各2 μL，ddHO 补足至50 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共30个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物送北京博迈德基因技术有限公司进行测序。将获得的ITS 基因序列在NCBI 中比对，从GenBank 下载相关序列，用MEGA 7.0 软件进行亲缘关系分析，在8 株病原菌中随机选择3 株构建系统发育树。

1.2.4 芦笋茎枯病病原菌致病性测定 按照柯赫氏法则，选取盆栽半年生芦笋幼苗，对分离出的15株病原菌进行接种验证及致病性测定，每处理15株。将纯化培养后的分生孢子浓度调整为1 × 10个 ·mL（杨迎青 等，2012），在芦笋苗期，刺伤茎部进行喷雾接种，每处理喷施30 mL，以喷施清水为空白对照。待接种部位发病后，对发病部位的病斑再次进行病原菌分离、纯化，观察菌落、分生孢子器和分生孢子特征，如果与最初分离出的病原菌一致，则可确定为该病原菌。

接种14 d 后，对接种幼苗进行病情调查，计算其病情指数。

按照杨迎青等（2012）的标准进行病情分级：0 级，全株无病斑；1 级，发病面积占总面积6%以下；2 级，发病面积占总面积的6%～10%；3 级，发病面积占总面积的11%～20%；4 级：发病面积占总面积的21%～30%；5 级：发病面积占总面积的30%以上。

病情指数=∑（各级病株数 × 该级代表值）/（调查总株数 ×最高级代表值）× 100

1.2.5 不同药剂对芦笋茎枯病病原菌的室内生物活性测定 以菌株LS18102108 为试材，其致病性在15 株病原菌中最强。将该菌株置于PDA 培养基平板上，27 ℃恒温培养5 d 后，在菌落边缘打取直径5 mm 的菌饼。含药培养基的制备：将供试药剂（表1）配制成母液，然后按照浓度梯度，用加热融化后约55 ℃的液体PDA 培养基稀释，各药剂在PDA培养基中的终浓度分别为0（对照）、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg·mL，将直径5 mm 的菌饼接种于不同浓度含药培养基平板中心，有菌丝一侧向上，每处理重复3 次。接菌后25 ℃黑暗培养，待菌丝长满含0 μg·mL药剂的培养基平板时，采用“十”字交叉法测量每处理的菌丝直径，计算抑制率。

表1 芦笋茎枯病病原菌室内生物活性测定供试药剂

抑制率=（对照菌落直径 -处理菌落直径）/（对照菌落直径 -0.5 cm）× 100%

采用Microsoft Excel 软件对试验数据进行整理；采用IBM SPSS Statistics 20.0 软件，以防治药剂浓度的对数值为横坐标，以抑制率的生物几率值为纵坐标，计算各药剂的毒力回归方程和有效中浓度（EC）。

1.2.6 不同药剂对芦笋茎枯病活体盆栽药效评价 以菌株LS18102108 为试材，参试药剂及试验浓度详见表2。分别将5 种稀释后的药剂均匀喷施于半年生盆栽芦笋幼苗上，每种药剂喷施30 mL，2 h 后待药液完全被芦笋吸收后接种病原菌，方法同1.2.4，设置清水对照。每个处理3 次重复，共30 株。待对照植株发病后，计算病情指数和防效。

表2 芦笋茎枯病活体盆栽药效评价供试药剂

防效=（对照病情指数 -处理病情指数）/对照病情指数 × 100%

2 结果与分析

2.1 芦笋茎枯病田间发病症状

在浙江杭州佳慧芦笋种植基地发现的芦笋茎枯病主要为害植株茎部，嫩茎和嫩枝最易感病（图1-A）。典型症状为：初期，茎秆上出现外缘呈水渍状的椭圆形小斑；之后病斑逐渐扩大，中间呈灰褐色大斑（图1-B）；后期，病斑上出现许多散生或呈轮纹状排列的黑色小粒点（图1-C）；病斑持续扩展并环绕茎部约一周后，植株茎叶迅速变黄枯死，直至整株死亡（图1-D）。

图1 芦笋茎枯病田间症状

2.2 芦笋茎枯病病原菌形态特征

将获得的纯化菌株在PDA 培养基上25 ℃培养7 d 后，观察菌落形态。该病原菌菌落平坦，初期为白色，气生菌丝平铺（图2-A）；随着培养时间延长，菌落呈灰白色或淡黄绿色（图2-B、C）；分生孢子器形成于子座中，子座黑色，常数个集结成块，呈球形，成熟后外露于菌丝层，培养后期子实体分泌橘黄色液状物（图2-D、E）；分生孢子呈长椭圆形或卵圆形，少数呈梭形，无色，单孢，内有2 个油球（图2-F）。

图2 芦笋茎枯病病原菌形态特征

2.3 芦笋茎枯病病原菌分子生物学鉴定

采用通用引物ITS1/ITS4 和特异性引物SF/SR 对病原菌DNA 进行扩增，分别获得长度为650 bp 和401 bp 的目标片段（图3），获得的ITS 基因序列在NCBI 上的比对结果与天门冬拟茎点霉（KJ801804.1）的序列同源性为100%。

图3 芦笋茎枯病病原菌ITS1/ITS4 和SF/SR 引物扩增结果

将该序列在GenBank 数据库中比对分析后发现，菌株LS18102101、LS18102108 和LS18102110与世界不同地区的拟茎点霉（）（LC203583.1、LC203582.1、LC333579.1、KJ801804.1、KC456277.1、AB247166.1 和HQ832822.1）遗传距离接近，均属于同一分支（图4）。综合形态学特征，确定其为天门冬拟茎点霉〔（Sacc.）Bubak〕。

图4 根据ITS 基因同源性构建系统发育树

2.4 芦笋茎枯病病原菌致病性测定

盆栽试验中，接种病原菌的芦笋茎叶在接种8 d 后开始发病。发病初期茎秆开始出现病斑，嫩茎上逐渐出现小黑点，之后由于上部缺水叶部变黄，与田间症状一致（图5）。将接种后发病的芦笋茎部进行组织分离，镜检分离出的病原菌与接种的病原菌形态一致，表明分离获得的病原菌为芦笋茎枯病致病菌。接种病原菌的植株发病率均为100%，病情指数在34～63 之间，编号LS18102108 的菌株致病性最强，清水对照未发病。

图5 芦笋接种茎枯病病原菌发病结果

2.5 不同药剂对芦笋茎枯病病原菌的室内生物活性测定

从表3 可以看出，在供试药剂中，25%吡唑醚菌酯悬浮剂对芦笋茎枯病病原菌菌丝生长抑制作用最强，在供试浓度下对菌丝完全抑制；75%百菌清可湿性粉剂、22.5%啶氧菌酯悬浮剂、70%丙森锌可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂和50%异菌脲可湿性粉剂对病原菌菌丝生长的抑制作用均较强，EC值分别为0.13、0.19、2.04、2.24 μg ·mL和2.25 μg·mL。

表3 不同药剂对芦笋茎枯病病原菌的室内生物活性测定

2.6 不同药剂对芦笋茎枯病活体盆栽药效评价

从表4 可以看出，25%吡唑醚菌酯悬浮剂的防效最好，达94.56%，与室内生物活性测定结果相符；10%苯醚甲环唑水分散粒剂、75%百菌清可湿性粉剂、50%异菌脲可湿性粉剂、22.5%啶氧菌酯悬浮剂均有不同程度的防治效果，防效分别为59.78%、58.15%、47.82%、44.56%。

表4 不同药剂对芦笋茎枯病病原菌的药效评价

3 结论与讨论

本试验通过对芦笋发病植株分离得到的病原菌进行显微形态学观察、分子生物学鉴定、接种验证和致病性测定，明确该芦笋茎枯病病原菌为天门冬拟茎点霉，这与该病害的病原菌已有报道相符（刘克均 等，1991；陈建 等，2020）。

芦笋茎枯病是芦笋主要病害，用于防治该病害的化学药剂较多，仅在我国登记的就有嘧菌酯、代森锌、苯醚甲环唑、福美双、苯菌灵等10 种杀菌剂和1 种诱导抗病激活剂氨基寡糖素（中国农药信息网，http：//www.chinapesticide.org.cn/fwb/index.jhtml），也有报道表明吡唑醚菌酯、醚菌酯等杀菌剂（董克锋 等，2015；刘美玲 等，2019；宋化稳 等，2019）和春雷霉素、多抗霉素等抗生素（杨迎春等，2018；杨帅 等，2021）对芦笋茎枯病也有较好的防治效果。为筛选出更多对芦笋茎枯病具有较好防治效果的杀菌剂，本试验选取了部分与已经登记防治该病害的药剂具有相同作用机理的杀菌剂，如代森锌与丙森锌，均属于二硫代氨基甲酸盐类杀菌剂；嘧菌酯与醚菌酯、吡唑醚菌酯、啶氧菌酯均为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，其中吡唑醚菌酯和啶氧菌酯均为甲氧基丙烯酸酯类较新的杀菌剂，且活性较高。本试验对11 种药剂进行了生物活性测定，结果发现吡唑醚菌酯可以完全抑制芦笋茎枯病菌菌丝的生长；之后在对5 种杀菌剂防治芦笋茎枯病的盆栽试验效果评价时也发现，吡唑醚菌酯表现最佳，防效可达到94.56%，该杀菌剂在我国登记可用于防治芦笋褐斑病（Sacc.）（中国农药信息网）。因此，在芦笋发生茎枯病或者褐斑病时选用吡唑醚菌酯进行防治，具有兼防（预防）两种病害的作用，提高了杀菌剂的使用效率，降低了用药量，具有节本增效的意义。

为降低田间频繁用药可能导致的抗药性问题，增加交替用药的选择范围。本试验在生物活性测定中选择了具有不同作用机理的杀菌剂，如二甲酰亚胺类触杀性、保护性杀菌剂异菌脲和腐霉利，应用范围和杀菌谱较广的琥珀酸脱氢酶抑制剂氟吡菌酰胺，以及广谱、保护性杀菌剂百菌清，测定结果发现异菌脲和百菌清对芦笋茎枯病病原菌均表现较好的生物活性，EC值分别为2.25 μg·mL和0.13 μg·mL，可作为田间防治芦笋茎枯病的替换用药。

本试验同时发现，在我国登记用于防治芦笋茎枯病的杀菌剂嘧菌酯的生物活性较差，其EC值高达48.70 μg·mL。嘧菌酯在杭州市佳慧芦笋种植基地属于防治芦笋茎枯病的常用药剂，推测可能是由于该药剂在田间应用频繁，导致当地芦笋茎枯病病原菌菌株存在一定程度的抗药性，因此活性降低。生产中建议合理用药，多种作用机理杀菌剂轮换使用以减少抗药性发生。

盆栽药效评价试验中，选择先施药后接种的预防用药措施，筛选出了对茎枯病防治效果较好的吡唑醚菌酯。建议在田间芦笋茎枯病易发病季节，提前选择吡唑醚菌酯进行1～2 次预防用药，不但可以预防茎枯病的发生，也可以兼防褐斑病。但由于吡唑醚菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，国际杀菌剂抗性行动委员会将该类杀菌剂定义为高风险抗药性类别（FRAC，2021），应用时需要与其他杀菌剂轮换使用，且单个生长季节不要超过3 次用药。同时也需要重视新型杀菌剂的开发和应用（王建国 等，2002），为更好地防控芦笋茎枯病提供资源储备。