‘摩尔多瓦’葡萄MYB4b基因克隆鉴定及表达分析

2022-05-29孙洋王超霞田淑芬刘丹罗盼王荣

中外葡萄与葡萄酒 2022年3期

孙洋，王超霞，田淑芬*，刘丹，罗盼，王荣

（1. 天津农学院园艺园林学院，天津 300384；2. 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，天津 300192）

花色苷是苯丙烷代谢途径的主要物质，是自然界广泛存在的类黄酮物质[1]。葡萄种植和酿酒加工过程中会产生大量枝条和果皮残渣，其中仍含有丰富的花色苷，可用于一些高附加值保健食品的开发，具有广泛的应用前景[2]。

MYB转录因子在葡萄花色苷的合成过程中起着决定性作用。根据葡萄基因组信息，预测有279个MYB转录因子[3]，从PlantTFDB上查询到葡萄R2R3类MYB转录因子约有190个。根据蛋白质羧基端DNA结合区保守氨基酸的基序，这些R2R3类MYB转录因子可分为28个亚类，广泛参与植物初生及次生代谢、细胞分化、激素信号传导、生长发育调控、生物及非生物逆境响应等生命过程[4]。其中MYBAl和MYBA2这两个位于2号染色体上的基因位点对葡萄的颜色起决定性影响。它们形成一个高度交联的基因簇，长度约为200 kb，通过调控UFGT基因的表达来实现对花色苷合成的作用[5-7]。在各种葡萄品种中，MYBAl基因位点的基因型主要包括VvmybAla、VvmybAlb和VvmybAl等位基因。在葡萄发育过程中，将逆转录转座子Gretl（Retrotransposon 1）插入VvmybAl编码序列的上游启动子区域会导致花色苷相关基因的表达受到抑制，从而使葡萄皮无法合成花青素，所以会出现绿色葡萄果实[7-9]。VvmybAlb和VvmybAl具有通过调节UFGT的表达而促进花色苷合成的功能[10]。本课题组前期研究发现，花色苷合成相关基因的启动子序列上存在MYB4结合的顺式作用元件，据此推测，MYB4b作为MYB家族的成员之一，可能参与调控果实花色苷的合成。

‘摩尔多瓦’（Moldova）葡萄于1997年从罗马尼亚引入，原产地为摩尔多瓦共和国。该品种为欧美杂交种，果实着色力强，能有效抵抗霜霉病的侵染，对天气的包容度极高。天津地区的气候特点是季节气候变化明显，干旱多风，土壤盐渍化程度高，因此，‘摩尔多瓦’葡萄适合在天津种植。为了解‘摩尔多瓦’葡萄MYB4b转录因子的相关生物学功能，提高其利用效率，试验利用PCR技术克隆获得MYB4b转录因子的基因序列，并对其进行生物信息分析与预测，采用荧光定量PCR方法检测MYB4b基因在‘摩尔多瓦’不同组织部位和不同农艺技术处理下的转录表达水平，同时检测了相应的花色苷含量，为研究其在葡萄生理胁迫过程中所作出的调控应答奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料与处理

试验于2021年8月5日至2021年12月25日在天津市武清区金锅农业生态园进行。‘摩尔多瓦’葡萄为多年生自根苗，棚架栽培，定植株距1.0 m，行距3.0 m，棚架高4 m。每株葡萄结果主蔓1个，每果枝保留1穗果，整株保持40穗。

采集了花前7 d（7 dbf）、花期（0 daf）和花后7 d（7 daf）的花序、茎尖、幼茎、老茎、新叶、老叶、幼卷须、老卷须，以及不同发育时期的果实：幼果期（开花后14 d）、转色期（开花后56 d）及成熟期（开花后126 d）。采集‘摩尔多瓦’转色期的果实进行无菌水（CK）、0.3% NaCl、60 g·L-1PEG6000、40 mg·L-1碧护、500 mg·L-1壳聚糖共计5个浸泡处理，取处理0、3、6、12、24 h，2、4、6、8 d（10个时间点）的样品进行检测，3次重复。样品采集后存于液氮，用于RNA提取。

1.2 总DNA提取及目标基因克隆

用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit试剂盒（9768，TaKaRa）提取葡萄叶片总DNA，具体提取方法参照试剂盒说明书。

在NCBI中获得MYB4b的全长序列，并采用Primer 5软件设计引物（表1）。PCR扩增目标基因，回收纯化特异性扩增产区与天根的pGM-T载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选后将阳性菌液送生工生物工程股份有限公司进行测序。

表1 本文所采用的引物信息Table 1 Primer information used in this paper

1.3 生物信息学分析

采用ProtParam预测蛋白理化性质；SignalP 4.1 Server预测信号肽；ProtScale预测亲水性/疏水性；TMHMM-2.0 Server预测跨膜区；NCBI的CDD（Conserved Domain Database）预测功能结构域；SOPMA预测蛋白质二级结构及三级结构；Psort和Cell-PLoc 2.0进行亚细胞定位；MEGA 5.1进行氨基酸序列多重比对和系统进化树分析。

1.4 总RNA提取及实时荧光定量PCR

用HiPure Plant RNA mini Kit试剂盒（R4151-02，Magen）提取成熟叶、幼嫩叶、幼茎、老茎、幼卷须、老卷须、茎尖，以及各个阶段的花序和果实总RNA，反转录后得到cDNA。按照SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）的操作指导，在Illumina-Eco荧光定量PCR仪（美国ABI）上测定基因的表达量。

以延伸因子EF-1α为内参基因进行荧光定量PCR，采用Primer5软件设计相关引物（表1）。10 μL反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 5 μL、上下游引物（10 mmol）各0.3 μL、cDNA模板1 μL和RNase-free水3.4 μL。反应条件：98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环；最后进行溶解曲线测定。荧光定量结果通过相对定量法（2-△△t）进行分析，采用Excel软件绘图。

1.5 总花色苷含量测定

总花色苷含量用盐酸甲醇法测定，具体方法参照洪燕红的试验方法[11]。

2 结果与分析

2.1 MYB4b基因克隆与序列分析

用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit试剂盒（9768，TaKaRa）提取葡萄叶片总DNA凝胶电泳结果显示提取的DNA条带清晰完整（图1左），Nanodrop 2000微量紫外分光光度计检测结果得到所提DNA的浓度为324.54 μg·μL-1，OD260/280的比值为1.84。结果表明所提的基因组DNA浓度和纯度满足后续试验的要求。

从电泳图（图1中）中可以看出，PCR扩增得到大小不同的多个片段。根据DNA marker的位置和预期目标产物的大小，将700～1000 bp大小的电泳条带均进行切胶回收。根据TA克隆载体的重组原理，蓝白斑筛选结果显示（图1右），蓝色菌落中不含目的片段，白色菌落可能含有目的片段。

图1 ‘摩尔多瓦’葡萄基因组DNA（左）和PCR产物（中）电泳图及蓝白斑筛选图（右）Figure 1 Electrophoresis of genomic DNA (left) and PCR products (middle) and blue and white spot screening map (right) of 'Moldova'

Sanger测序结果分析表明，PCR克隆得到的片段即为MYB4b基因序列，该基因含有2个外显子，1个内含子，转录的mRNA序列总长为729 bp，共编码242个氨基酸，单链分子量为27 311.04 （表2）。

表2 MYB4b基因序列分析Table 2 Sequence analysis of MYB4b gene

2.2 生物信息学分析

利用ProtParam在线软件预测一级结构和理化性质，MYB4b蛋白分子式为C1178H1880N360O357S16，原子总数为3791，分子量为27311.04。理论等电点pI为8.47，为碱性蛋白。氨基酸组成Leu最多，占11.2%；Gln最少，占0.4%；未出现Pyl、Sec。带正电荷氨基酸残基总数（Asp＋Glu)为33，带负电荷氨基酸残基总数（Arg＋Lys)为37。脂溶系数为73.35，总平均疏水系数为-0.705，属于疏水性蛋白。半衰期为30 h，不稳定系数55.60，根据不稳定参数值在40以下才是稳定蛋白的标准，可推测MYB4b翻译出来的蛋白为不稳定蛋白。

使用NCBI的Conserved Domain Database数据库对所获得的‘摩尔多瓦’葡萄MYB4b蛋白的氨基酸序列进行保守结构域分析（图2）。结果表明，MYB4b蛋白在第1～131个氨基酸之间含有一个PLN03091功能结构域，该结构为转录阻遏型因子MYB5的保守结构域，E-value为6.1e-73，且PLN03091是超家族cl33633的唯一成员。

图2 MYB4b蛋白保守结构域预测分析Figure 2 Prediction and analysis of conserved domain ofMYB4bprotein

使用在线软件预测‘摩尔多瓦’葡萄MYB4b蛋白的二级和三级结构（图3）。MYB4b蛋白的二级结构中，主要是有123个氨基酸位点形成无规则卷曲，占比达到了50.83%；其次为80个氨基酸位点形成的α-螺旋占比达到33.06%，24个氨基酸位点形成的β-折叠占比达到9.92%，15个氨基酸位点的β-转角占比达到6.20%。MYB4b蛋白的三级结构与二级结构特点相吻合，为螺旋-折叠-无规则卷曲。

图3 MYB4b蛋白二级结构（左）和三级结构（右）预测Figure 3 Secondary (left) and three-level (right) structures prediction of MYB4b protein

2.3 MYB4b蛋白系统进化分析

采用在线软件ProtScale对‘摩尔多瓦’葡萄MYB4b蛋白氨基酸序列进行亲水性/疏水性预测。由图4可知，MYB4b蛋白在多肽链第162位氨基酸最低分值为-3.144，疏水性最强；而在蛋白多肽链第200位氨基酸亲水性分值最高，为1.856，疏水性最弱。总体而言，MYB4b蛋白氨基酸序列亲水氨基酸分布较均匀，且亲水氨基酸数量多与疏水氨基酸，总体平均疏水系数为-0.705。因此推测MYB4b蛋白为亲水蛋白。

图4 MYB4b蛋白亲水性/疏水性预测Figure 4 Prediction of hydrophobicity/hydrophobicity of MYB4b protein

系统发育进化分析结果表明（图5），目的基因MYB4b与刺葡萄（Vitis davidii）的MYB相关蛋白308的编码基因和河岸葡萄（Vitis riparia）的MYB4a转录因子同源性最高，表明两者亲缘关系较近。与其他物种的MYB序列聚类分析发现，葡萄MYB4b与拟南芥的同源关系较近，反而与葡萄的其他转录因子，如MYB14、MYB15的亲缘进化关系相对较远。此外，对葡萄不同MYB转录因子进行聚类分析发现，相比对VvMYB24、VvMYB44、VvAPL来讲，MYB4b与MYB14、MYB15的同源性相对较高，但处在不同分支。由此推测在葡萄进化过程中，MYB4b、MYB14/15和VvMYB24/44，可能来自不同的进化途径，属于不同的R2R3-MYB亚型。

图5 MYB转录因子系统进化树Figure 5 Phylogenetic tree of MYB transcription factors

2.4 不同组织MYB4b基因的表达模式及花色苷分布

如图6所示，在‘摩尔多瓦’葡萄不同时期的花序、茎尖、幼茎、老茎、新叶、老叶、幼卷须、老卷须，以及不同时期的葡萄果实（幼果期、转色期及成熟期）中均检测到MYB4b基因的表达，但在各组织中的表达量不同。其中，在茎尖和花序（7 dbf）中的表达量较高，其次是花序（0 daf）中，而在幼果期果实中的表达量较低（图6）。比较MYB4b基因在老叶和新叶中的表达发现，MYB4b在老叶中的表达量高于新叶。

图6 不同组织部位的MYB4b基因的组织表达模式（左）及花色苷含量（右）Figure 6 Relative expression of MYB4b (left) and anthocyanin contents (right) in different tissue parts

如图6所示，‘摩尔多瓦’葡萄不同组织部位中均含有花色苷。其中，花色苷在葡萄果实成熟期含量显著高于其他组织部位，是花序（7 dbf）中花色苷含量的3.6倍，是花序（7 daf）中花色苷含量的50倍。比较花色苷在老叶和新叶的含量发现，老叶（0.756 mg·g-1）中的花色苷含量略高于新叶（0.737 mg·g-1）；比较花色苷在老卷须和幼卷须的含量发现，老卷须（0.149 mg·g-1）中的花色苷含量低于新卷须（0.444 mg·g-1）。

2.5 离体处理对MYB4b的基因表达和花色苷的影响

由图7可知，盐胁迫下，果实中MYB4b基因的表达呈先升高后下降趋势，以处理6 h的MYB4b的表达量最高，之后逐渐回落。PEG诱导的干旱处理中，处理3 h的表达量较处理前显著上升，24 h明显回落，但处理6 d的表达量再次显著上升。葡萄果实在碧护处理中，MYB4b基因的表达量在处理的各个时间点均显著低于0 h，但6、12、24 h时均显著高于同时期的清水处理，而处理2、4、8 d，MYB4b基因的表达量明显下调，显著低于处理前。葡萄果实在壳聚糖处理12 h前MYB4b基因的表达逐渐增加，在12 h达到最高值，随后MYB4b基因的表达开始降低，自2 d开始各处理时间点MYB4b基因的表达量均低于处理前。上述结果表明，0.3%盐、PEG6000、碧护和壳聚糖处理下调MYB4b基因的表达，其中0.3%盐和壳聚糖的下调表达更强烈。

图7 离体处理下MYB4b基因的表达变化Figure 7 Expression changes of MYB4b gene under in vitro treatment

由图8可知，盐胁迫下（图8A），果实中花色苷的含量变化先增加后减少，以处理6 h花色苷的含量最高，处理6 h后，花色苷的含量逐渐回落，在处理4 d时达到次高值。PEG诱导的干旱处理（图8B），果实中花色苷的含量变化先增加后减少，以处理4 d时花色苷的含量最高，显著高于其他组织部位，是处理0 h的5.8倍。碧护处理中（图8C），花色苷含量在处理6 h时达到最高值，6 h后逐渐降低，在处理6 d时有所回升，却仍低于处理6 h的花色苷含量，是处理6 h的0.65倍。壳聚糖处理中（图8D），果实中花色苷的含量变化先减少后增加，以处理4 d时花色苷的含量最高，显著高于其他组织部位，处理0 h的花色苷含量为次高值。上述结果表明，0.3%盐、PEG6000、碧护和壳聚糖处理均可促进花色苷的合成，但花色苷含量最高的出现时间不同，其中0.3%盐和碧护处理均在处理6 h时花色苷含量最高，PEG6000和壳聚糖处理均在处理4 d时花色苷含量最高。

图8 花色苷在0.3%盐溶液（A）、PEG6000 (B)、碧护（C）和壳聚糖（D）处理中的含量Figure 8 Anthocyanin contents in in vitro treatment of 0.3% salt (A)、PEG6000 (B)、Bihu (C) and chitosan (D)

3 讨论

MYB转录因子家族成员均含有MYB保守结构域[12]。在物种的进化过程中，基因的保守氨基酸序列变化很小，决定着基因的功能和类型。根据NCBI的CDD数据库分析得到MYB4b蛋白在第1～131位碱基之间含有一个PLN功能结构域[13-14]。前人研究发现，PLN保守结构可能是一个含有多个结构域的模型，是转录阻遏型因子MYB5的保守结构域，说明MYB4b转录因子属于典型的MYB家族基因，可能具有转录抑制作用，其具体的功能有待进一步的试验验证。

由于转录调控因子需要与基因组DNA下游靶基因的顺式作用元件相结合，从而发挥其对下游基因的激活或者抑制等调控作用。当转录调控蛋白在细胞质中完成翻译修饰后，需要特定的核定位信号引导其从细胞质转运到细胞核中，因此转录因子的亚细胞定位大多是在细胞核中，如PbMYB3R、VdMYB14转录因子的检测与鉴定[15-16]。亚细胞定位预测结果表明，MYB4b转录因子定位于细胞核中，说明其含有的核定位信号，可将其翻译修饰后的蛋白质从细胞质转运到细胞核中，有助于其PLN保守结构域结合到基因组DNA上，从而发挥转录激活或抑制等调控功能。

在植物中，MYB基因家族具有悠久的进化历史。早期的系统进化分析推测，在十亿年前就出现了MYB结构域[17-18]。与动物相比，植物MYB基因家族系统性分化程度较低，数目众多，加大了对其进化研究的困难[19-21]。本文MYB4b转录因子与其他物种以及葡萄其他MYB转录因子构建系统进化树的结果表明，MYB4b与刺葡萄（Vitis davidii）的MYB相关蛋白的编码基因以及河岸葡萄（Vitis riparia）的MYB4a转录因子同源性最高，表明两者亲缘关系较近。

MYB转录因子是植物中非常重要的一类转录因子，是花青素生物合成中MBW复合物的主要调控因子[22]。Zahra[23]等研究也发现，MYB影响植物中花青素、黄酮类化合物的合成。本研究通过组织表达谱分析发现，MYB4b在‘摩尔多瓦’葡萄果实幼果期的表达量最低，在果实转色期及成熟期低表达，推测其可能负调控葡萄果实花色苷的合成。此外，MYB4b与MYB14、MYB15的同源性相对较高，李慎昌[24]的试验结果表明，VdMYB14能够有效抑制花色苷的合成，推测MYB4b抑制花色苷的合成。

碧护是一种植物生长调节剂，其作用机理是让植物获得抗性物质，提高自我修复功能，它能激活植物体各种酶的活性，促使植物叶片把光合效能转化为化学能[25]。壳聚糖在许多园艺作物中的应用潜力多有研究，包括诱导防御反应、改善农艺性状、果蔬采后管理、促进植物生长和增强生理活性等[26]。本研究发现，0.3%盐、干旱、碧护和壳聚糖处理均下调MYB4b基因的表达，推测对花色苷的合成起促进作用。MYB4b基因是否对葡萄果实花色苷的合成有影响待进一步的验证分析。