高效液相色谱法测定两面针药材中2种成分含量*

马 庆，魏伟锋，袁焕合，许 雷，张洪胜，邬国松，陈剑洪，韩正洲，林锦锋△

（1.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110；2.广东省药品检验所，广东 广州 510663；3.广东省广州市白云区人民医院，广东 广州 510006）

两面针Zanth oxylum nitidum（Roxb.）DC.以蔓椒之名始载于《神农本草经》［1］，列为下品，亦收载于《名医别录》《本草经集注》《本草图经》《本草术原》等本草名著，别名甚多。其味苦、辛，性平，有小毒，归肝、胃经，有活血化瘀、行气止痛、祛风通络、解毒消肿功效，可外用治疗跌扑损伤、胃痛、牙痛、风湿痹痛、毒蛇咬伤、烧烫伤等［2］。两面针是60余种中成药的组方药材之一，药理作用广泛，临床应用价值较高，市场需求逐年上升。2020年版《中国药典（一部）》收录两面针的药用部位为根，对其质量要求为含氯化两面针碱（C21H18NO4·Cl）不得少于0.13%，加之其生长年限长、产量低、可再生能力差、土地沙漠化等因素，致使其严重供不应求。而历代本草、地方标准及方剂均有其不同药用部位（包括果实、根、茎、叶）的记载，但多以根和茎入药（见表1）。有研究证实，两面针根部和茎的成分种类基本一致［3-4］，且药理作用及其对应的药效也基本相似［5-6］。两面针药材中的主要活性成分为氯化两面针碱、白屈菜红碱、8-甲氧基二氢白屈菜红碱及橙皮苷等化合物，其中前两种成分含量较高［3，7］。因此，本研究中拟采用高效液相色谱（HPLC）法测定上述2种成分含量，以期为两面针药材资源的可持续发展、合理开发利用提供参考。现报道如下。

表1 两面针药用部位Tab.1 Medicinal parts of Zanthox yl um nit id um

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（含DAD检测器，美国Agilent公司）；CP225D型分析天平（德国Sartorius公司）；UV-2550型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；Milli-Q超纯水处理系统（美国Millipore公司）。

1.2 试药

氯化两面针碱对照品（批号为110848-201604，含量91.0%），白屈菜红碱对照品（批号为111718-201402，含量80.5%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。两面针根部与茎部样品共21批（编号1～21，相关情况见表2），经广西壮族自治区中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为正品（凭证标本存放于该研究院标本馆）。

表2 样品信息Tab.2 Information of the samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo BETASIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：含0.2%三乙胺的0.3%磷酸溶液-乙腈（77∶23，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：273 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

2.2 溶液制备

称取氯化两面针碱对照品12.51 mg、白屈菜红碱对照品10.78 mg，精密称定，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得含氯化两面针碱569.205μg/mL、白屈菜红碱433.895μg/mL的混合对照品溶液。取药材样品适量，研为粉末，取0.5 g（过二号筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90%甲醇100 mL，称定质量，加热回流60 min，放冷，再称定质量，用90%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相应位置有吸收峰。理论板数按氯化两面针碱峰及白屈菜红碱峰计均应不低于3 000，分离度均大于1.5，基线分离良好。详见图1。

线性关系考察：取2.2项下混合对照品溶液适量，加甲醇稀释，得氯化两面针碱质量浓度分别为113.841，45.536，22.768，11.384，4.554，1.821μg/mL，白屈菜红碱质量浓度分别为86.779，34.712，17.356，8.678，3.471，1.388μg/mL的系列混合对照品溶液。按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量为横坐标（X，μg）、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得氯化两面针碱回归方程为Y1=4 112.864X1-18.523（r=0.999 9，n=5），白屈菜红碱回归方程为Y2=5 594.700X2-20.357（r=0.999 9，n=5）。结果表明，氯化两面针碱、白屈菜红碱进样量分别在0.018 2～1.138μg和0.013 9～0.868μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取药材样品（编号为1），按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，平行测定6次，记录峰面积。结果氯化两面针碱、白屈菜红碱峰面积的RSD分别为1.00%和0.80%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下供试品溶液，室温下放置0，2，4，8，16，24，48 h时，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果氯化两面针碱和白屈菜红碱峰面积的R S D分别为0.30%和1.00%（n=7），表明供试品溶液室温放置48 h内稳定。

重复性试验：取1号样品，按2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果氯化两面针碱和白屈菜红碱含量的RS D分别为0.70%和2.10%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含0.168 6%（未扣除水分）氯化两面针碱、0.138 7%（未扣除水分）白屈菜红碱为的1号样品共6份，每份约0.25 g，精密称定，分别精密加入一定质量浓度的混合对照品溶液，再定容至100 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取21批药材样品，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以外标一点法计算含量。结果见表4。

表4 样品含量测定结果（%）Tab.4 Results of content determination of nitidine chloride and chelerythrine in the samples（%）

可见，21批药材样品中氯化两面针碱和白屈菜红碱总含量为0.068%～0.395%，平均0.219%，因各批次间的测定结果较分散，以该值下调30%，即得含量为0.153%。故建议，规定本品含氯化两面针碱和白屈菜红碱的总含量不得少于0.150%。在该条件下，21批药材样品中有6批不符合规定。

3 讨论

3.1 检测波长选择

预试验中，分别在200～500 nm紫外波长范围内对氯化两面针碱对照品溶液、白屈菜红碱对照品溶液和混合对照品溶液进行扫描，结果分别在272，282，273 nm波长处有最大吸收峰。因本研究需同时测定此两种成分含量，故确定紫外检测波长为273 nm。

3.2 色谱柱和流动相选择

预试验中，以含0.2%三乙胺的0.3%磷酸溶液-乙腈（78∶22，V/V）为流动相，比较了Thermo公司BETASIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）和BDS HYPERSIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），结果前者峰形较好，而后者色谱峰拖尾较严重，故采用前者作为本研究的色谱柱。还比较了（A）0.1%甲酸（用三乙胺调pH至4.5）-乙腈（75∶25，V/V）、（B）含0.2%三乙胺的0.3%磷酸溶液-乙腈（77∶23，V/V）、（C）1 mmol/L庚烷磺酸钠（用3 mol/L磷酸调pH至2.6）-乙腈（70∶30，V/V）3种流动相，结果以流动相（B）峰形最好。

3.3 提取方式考察

预试验中，考察了2种提取方式（超声提取、加热回流），并在此基础上采用3因素、3水平的正交试验考察提取溶剂（50%，70%，90%甲醇）、提取时间（30，60，90 min）、溶液用量（25，50，100 mL）对提取效果的影响。结果表明，加热回流提取效果略优于超声提取，故选择加热回流提取；对提取得率的影响从大到小为甲醇体积分数＞溶剂体积＞提取时间，故最佳的提取条件以90%甲醇100 mL为溶剂，提取60 min。由此制备的供试品溶液色谱峰数目最多，峰面积较大，峰形较好。

3.4 方法评价

两面针含较多种化学成分，目前标准中的薄层色谱鉴别和含量测定项目仅针对其个别成分，不能综合反映两面针药材中各主要成分含量。因此，本研究中利用HPLC法对氯化两面针碱和白屈菜红碱进行定量分析。本方法重复性好，可操作性强，可用于两面针药材整体化学质量的一致性评价。

药材样品中氯化两面针碱和白屈菜红碱总含量（以下简称总含量）最高的是20号（越南-2），最低为14号（广东高州市镇江镇）。在栽培的药材样品中，同样为5年生栽培样品，2号（广西大新县福隆乡）总含量明显高于1号（广东电白区麻岗镇），且广东药材样品指标性成分含量普遍低于广西药材样品。就本研究中建议总含量不得少于0.150%的结果而言，广西更适合两面针的种植，且种植时间为5～6年，该结果在一定程度佐证了广西为两面针的道地产区，同时也为两面针的采收时间提供了一定参考。由于本研究中收集的21批药材采收时期、生长年份不同，同时也受到地域水土、气候等因素影响，可能导致药材化学成分含量差异较大，后续将会收集更多的药材样品对本研究进行深入分析。

综上所述，本研究中对不同来源（栽培、野生、药材市场）21批两面针药材样品（茎、根）进行含量测定，并制订了氯化两面针碱和白屈菜红碱总含量限度，可有效评价两面针根及茎的质量，为两面针资源的可持续发展及合理开发利用奠定基础。