基于T 淋巴细胞PPAR-γ-核因子-κB 通路探讨平喘固本膏对支气管哮喘缓解期患者的作用机制*

于 鸿，计忠宇，赵 辉，卢丽艳，代良田

河北医科大学沧州中西医结合临床医学院，河北 沧州 061001

目前，全球哮喘患者人数约3亿，国内约有3000万，虽然治疗策略有所改进，但死亡率并未降低［1］。另外，在治疗过程中支气管哮喘缓解期极易被忽视，易致症状反复发作，加重病情，严重时可对患者生命造成威胁［2］。因此，支气管哮喘缓解期应给予及时有效的治疗和控制，防止病情加重、改善患者预后水平对临床具有重要意义。目前，西医常采用缓解支气管痉挛、控制气道炎症反应等治疗支气管哮喘缓解期，但部分患者易出现不良反应，影响其治疗依从性［3］。中医根据支气管哮喘患者具体病情对症治疗取得了满意疗效［4］。哮喘的发病与T淋巴细胞密切相关，而支气管哮喘的发病机理与多种包含核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）结合的κB 位点基因的持续表达相关［5］。因此，本研究基于T淋巴细胞过氧化物酶体增殖活化受体-γ（PPAR-γ）-NF-κB 通路探讨平喘固本膏对支气管哮喘缓解期患者的作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料将2017 年11 月至2019 年12 月于河北医科大学沧州中西医结合临床医学院诊治的100 例支气管哮喘缓解期患者采用随机数字表法分为对照组和治疗组各50 例，均为男性。治疗组患者年龄31～51 岁，平均（45.09±10.21）岁；病程1～7 年，平均（3.43±0.96）个月；哮喘控制测试（asthma control test，ACT）评分20～22分，平均（20.31±1.96）分。对照组患者年龄29～47岁，平均（39.69±8.99）岁；病程1～5 个月，平均（3.23±1.01）个月；哮喘控制测试（ACT）评分20～22 分，平均（20.27±1.89）分。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究方案符合《赫尔辛基宣言》相关要求，且经医院伦理委员会批准。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准根据《支气管哮喘防治指南（2020年版）》［6］制定。缓解期是指症状发作后，经治疗或未予治疗，下述症状、体征消失，症状及肺功能恢复到急性发作前水平，且持续3个月以上。1）以反复发作性气喘、胸闷等为主要临床症状，临床症状凌晨及夜晚尤为明显；可闻及双肺哮鸣音（其特点为呼气相，弥散性或散在）；自行缓解或经治疗缓解。2）若缺乏典型临床症状，则需具备下述任意试验中1项为阳性，a：支气管舒张试验、激发试验均为阳性；b：呼气流量峰值平均每日昼夜变异率超过10%或平均每周变异率超过20%；3）第1秒用力呼气容积（forced expiratory volume in the first second，FEV1）增加超过200 mL，且FEV1增加超过12%。

1.2.2 中医诊断标准根据《支气管哮喘中医诊疗专家共识（2012）》［7］中肺肾两虚证标准。主证：胸闷喘息、气息短促、肢体欠温、神疲懒言；次证：不耐劳累、脑转耳鸣、夜尿频多、腰膝酸软；舌脉：舌淡苔白，脉沉细。

1.3 纳入标准1）符合上述诊断标准者；2）对本研究药物不过敏者；3）1个月内未参加其他药物研究者；4）心肝肾等重要脏器功能正常者；5）知情同意。

1.4 排除标准1）其他特殊类型哮喘；2）依从性差及无法正常沟通者；3）存在严重循环及消化系统疾病；4）合并其他肺部特殊性病理表现者。

1.5 治疗方法

1.5.1 对照组吸入沙美特罗替卡松粉吸入剂（舒利迭，葛兰素史克公司，批号：H20121106，规格：50 μg/250 μg×60泡）每日2次，连续治疗1个月。

1.5.2 治疗组在对照组治疗的基础上予平喘固本膏。药物组成：黄精300 g，黄芪300 g，枸杞子200 g，女贞子200 g，补骨脂200 g，太子参200 g，白术200 g，地龙200 g，浙贝母200 g，五味子200 g，山药200 g，牡蛎200 g，玉竹200 g，苏子200 g，杏仁200 g，瓜蒌200 g，桑白皮200 g，厚朴200 g，陈皮200 g，款冬花200 g，紫菀200 g，防风200 g，党参200 g，半夏100 g，甘草300 g，将上述药物煎煮浓缩，再进行辨证论治后加鹿角胶、龟板胶、鳖甲胶、阿胶，并采用蜂蜜、饴糖或木糖醇收膏而成。

1.6 观察指标

1.6.1 临床疗效根据《支气管哮喘中医诊疗专家共识（2012）》［7］制定。治愈：气息短促、动则气促、胸闷等临床症状及体征均消失，ACT 评分≥24分，中医证候积分减少≥95%；有效：气息短促、动则气促、胸闷等临床症状及体征明显减轻，ACT 评分22～24 分，中医证候积分减少75%～94%；好转：气息短促、动则气促、胸闷等临床症状及体征均好转，ACT 评分20～22 分，中医证候积分减少35%～74%；无效：上述症状均无明显变化或加重。

1.6.2 中医证候积分根据《中医病症诊断疗效标准》［7］制定。根据胸闷喘息、气息短促、肢体欠温、神疲懒言的严重程度将其分为无、轻度、中度、重度，评分0～6 分；根据不耐劳累、脑转耳鸣、夜尿频多、腰膝酸软的严重程度将其分为无、轻度、中度、重度，评分0～3分，得分越高症状越明显。

1.6.3 HMGB1、cAMP、LTD4分别在治疗前后抽取患者静脉血5 mL，离心后分2 份于-35℃冰箱内保存备用。取1 份血清采用酶联免疫吸附法测定高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）及白三烯D4（leukotriene D4，LTD4）水平。

1.6.4 免疫功能取另外1 份血清采用酶联免疫吸附法检测免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）及免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）。

1.6.5 IL-10 及T 淋巴细胞NF-κB 活化率治疗前后抽取患者外周静脉血，肝素抗凝，采用密度梯度高心法将外周血单核细胞（peripheral blood monoculear cell，PBMC）分离，细胞悬于RPMI-1649 培养基中，细胞浓度设置为1×106/mL，在培养箱中加入PBMC悬液，培养2 h，淋巴细胞浓度设置为1×106mmol/mL，加入50 μg/mL 植物血凝素，接种到培养板中，单纯培养48 h。培养后取细胞悬液离心5 min，提取T 淋巴细胞上清液，封口，保存于-20℃冰箱内，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)水平。用T淋巴细胞沉淀涂片对NF-κ活性进行免疫化学染色，胞核染色呈棕黄色为阳性，NF-κ活化率（%）=阳性细胞数/总细胞数，在100 倍油镜下观察，每张片计数500个细胞。

1.7 统计学方法应用SPSS 21.0 软件分析数据，计量资料以±s表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中医证候积分治疗后两组患者胸闷喘息、气息短促、肢体欠温、神疲懒言、不耐劳累、脑转耳鸣、夜尿频多、腰膝酸软评分均较治疗前降低，治疗组降低更明显（P＜0.05），见表1。

表1 两组患者治疗前后中医证候积分比较（±s） 分

表1 两组患者治疗前后中医证候积分比较（±s） 分

注：*表示与同组治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

组别治疗组对照组例数50 50时间治疗前治疗后治疗前治疗后胸闷喘息4.87±0.37 0.46±0.12*#4.81±0.32 0.97±0.11*气息短促4.78±0.34 0.41±0.09*#4.78±0.29 0.93±0.10*肢体欠温4.72±0.32 0.39±0.11*#4.68±0.33 0.92±0.12*神疲懒言4.68±0.29 0.43±0.13*#4.62±0.31 0.91±0.14*不耐劳累2.12±0.21 0.38±0.11*#2.09±0.19 0.65±0.14*脑转耳鸣2.10±0.19 0.35±0.09*#2.07±0.17 0.63±0.12*夜尿频多2.11±0.15 0.36±0.13*#2.02±0.14 0.66±0.13*腰膝酸软2.08±0.14 0.32±0.12*#2.05±0.12 0.67±0.12*

2.2 临床疗效治疗组总有效率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组患者临床疗效比较

2.3 HMGB1、cAMP 及LTD4 水平治疗后两组患者HMGB1 及LTD4 水平均较治疗前降低，cAMP 水平升高，与对照组相比，治疗组HMGB1 及LTD4 水平更低，cAMP水平更高（P＜0.05），见表3。

表3 两组患者治疗前后HMGB1、cAMP及LTD4水平比较（±s）

表3 两组患者治疗前后HMGB1、cAMP及LTD4水平比较（±s）

注：*表示与同组治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

组别治疗组对照组例数50 50时间治疗前治疗后治疗前治疗后HMGB1（ng/mL）8.12±1.02 4.12±1.01*#8.07±1.04 6.23±1.06*cAMP（μmol/L）11.89±1.23 28.03±1.32*#11.76±1.28 20.18±1.37*LTD4（mg/L）128.98±5.93 52.19±5.88*#127.99±6.01 82.19±6.09*

2.4 免疫功能治疗后两组患者IgE 水平均较治疗前降低，治疗组降低更明显（P＜0.05）；IgM、IgG、IgA 水平均较治疗前升高，治疗组升高更明显（P＜0.05），见表4。

表4 两组患者治疗前后免疫功能比较（±s） g/L

表4 两组患者治疗前后免疫功能比较（±s） g/L

注：*表示与同组治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

组别治疗组对照组例数50 50时间治疗前治疗后治疗前治疗后IgE 80.24±3.29 49.87±3.32*#80.01±3.32 59.87±3.42*IgM 1.42±0.32 2.51±0.29*#1.46±0.35 2.03±0.31*IgG 6.47±0.67 8.36±0.72*#6.52±0.71 7.81±0.73*IgA 1.52±0.43 2.73±0.51*#1.54±0.45 2.11±0.48*

2.5 IL-10 及T 淋巴细胞NF-κB 活化率治疗后两组IL-10 水平较治疗前升高，T 淋巴细胞NF-κB活化率较治疗前降低，与对照组相比，治疗组IL-10水平更高，T淋巴细胞NF-κB活化率更低（P＜0.05），见表5。

表5 两组患者治疗前后IL-10及T淋巴细胞NF-κB活化率比较（±s）

表5 两组患者治疗前后IL-10及T淋巴细胞NF-κB活化率比较（±s）

注：*表示与同组治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

组别治疗组对照组例数50 50时间治疗前治疗后治疗前治疗后IL-10（pg/mL）6.09±0.43 9.69±0.36*#6.04±0.41 8.21±0.32*T淋巴细胞NF-κB活化率（%）54.89±7.63 27.98±7.21*#54.79±7.59 39.98±7.43*

3 讨论

支气管哮喘是由气道上皮细胞、嗜中性粒细胞、T 淋巴细胞、肥大细胞及嗜酸性粒细胞等参与的气道炎症性疾病，其主要特点为气道高反应性、痰液分泌增加及气道炎症反应，可诱发呼吸困难、胸闷、喘息、咳嗽等症状，且上述症状呈反复性发作。该病的发病机制尚不完全清楚，可能与雾霾、气道高反应性、神经机制及免疫-炎症反应等相互作用有关［8］。根据该病的发作程度可分为缓解期、慢性持续期及急性期，其中支气管哮喘缓解期是支气管哮喘治疗的关键期，其对该病的演变及预后造成不同程度影响。若未得到及时有效治疗，会延长支气管哮喘病程，致使气道产生不可逆性缩窄、重塑［9］。目前，临床以对症治疗为主，包括受体激动剂、茶碱类、糖皮质激素类等，但可能会引发心律失常等不良反应。因此，探索有效方法治疗支气管哮喘缓解期是临床医师研究的热点。

支气管哮喘缓解期属中医学“哮病”范畴，以痰、瘀、虚为主要病理因素，主要涉及肺脾肾3 脏，其中肺肾发病最为严重，主要病机为肺肾两虚，痰瘀阻肺结为窠臼。由于体内停积之痰，外感寒邪，致使气机紊乱，影响肺的宣发、肃降功能，与“伏痰”相互搏结，阻塞气道，诱发气急、喘息、哮喘等症状；肺病日久，耗伤肺气，影响肺的生理功能，造成机体内津液输布代谢异常，形成痰；肺气不足，则降低机体抵御功能，诱发疾病；肺气不足会耗伤他脏，导致肾气亏虚。因肺主呼气，肾主纳气，肺肾两虚可诱发气急、喘息等症状。肺为金，肾为水，金生水。根据“金水相生”“久病及肾”“久病必虚必瘀”理论，在养肺补肾健脾的同时，需祛痰活血化瘀［3］。平喘固本膏中君药党参补中益气，黄精补气养阴健脾、润肺益肾，黄芪益卫固表、补益肺气，3药合用益肺纳肾健脾，补3脏之不足；臣为女贞子、补骨脂、太子参、白术、地龙、浙贝母、五味子、山药、牡蛎、款冬花、桑白皮、枸杞子，可辅助君药增加补益之功，共凑调和阴阳、养肺滋阴、行气化痰止咳之功。佐药玉竹、苏子、杏仁、瓜蒌、厚朴、陈皮、紫苑、防风、党参、半夏化痰止咳，降逆平喘；使药甘草止咳平喘、调和诸药。李鞍英［10］研究指出，补肺固元膏可有效缓解支气管哮喘缓解期患者临床症状，降低炎症因子水平。本研究结果显示，治疗后治疗组患者胸闷喘息、气息短促、肢体欠温、神疲懒言、不耐劳累、脑转耳鸣、夜尿频多、腰膝酸软评分低于对照组，疗效优于对照组（P＜0.05），提示平喘固本膏可改善支气管哮喘缓解期患者临床症状。

HMGB1 属非组蛋白核蛋白之一，在炎症因子作用下可分泌止细胞，与机体炎症性疾病密切相关［10］。cAMP 可间接反映β2受体功能，而哮喘患者机体内外周血淋巴细胞β2受体呈降低趋势［11］。LTD4 属强效炎症介质之一，与支气管哮喘发病的多个环节密切相关，可促进支气管平滑肌收缩，增加气道黏液分泌，促使肺血管通透性增加［11］。本研究结果显示，治疗后治疗组HMGB1 及LTD4 水平较低，cAMP 水平更高（P＜0.05），提示平喘固本膏可降低支气管哮喘缓解期患者HMGB1 及LTD4 水平，提高cAMP 水平，促使β2受体功能恢复，抑制炎症反应。机体内体液免疫的重要因子包括免疫球蛋白IgE、IgM、IgG、IgA，支气管哮喘患者机体内免疫功能紊乱，血清IgE 水平升高，IgM、IgG、IgA水平降低［12］。本研究结果显示，与对照组比较，治疗后治疗组IgE水平较低，IgM、IgG、IgA水平更高（P＜0.05），提示平喘固本膏可调节支气管哮喘患者免疫功能。

多种细胞因子参与支气管哮喘的发病过程，PPAR-γ属配体激动的核转录因子中的一种，其可调控细胞炎症。NF-κB 可调控多种基因的表达及炎症因子水平，NF-κB 在哮喘患者中活化率较高［13］。以往研究指出，NF-κB 在重度哮喘状态下活化率极高，NF-κB 参与哮喘的发生、发展过程，IL-10对NF-κB的活性具有抑制作用，可抑制哮喘气道炎症中的炎症因子［13］。通过升高IL-10 水平可降低NF-κB 活性［14-15］。目前，临床关于PPAR-γ-NF-κB 通路探讨平喘固本膏对支气管哮喘缓解期患者的作用机制的研究鲜有报道。本研究结果显示，治疗后，与对照组相比，治疗组IL-10 水平更高，T淋巴细胞NF-κB活化率更低（P＜0.05），提示平喘固本膏可通过升高支气管哮喘患者T 淋巴细胞源性IL-10 水平从而抑制支气管哮喘患者T 淋巴细胞NF-κB 的活性，是抑制PPAR-γ-NF-κB 通路的机制之一，对改善支气管哮喘具有重要意义。黄精中的有效成分黄精多糖具有抗炎、增强免疫、抗病毒等作用［16］；黄芪的有效成分黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖类等均具有调节免疫、抗炎活性等作用，且可抗氧化，改善气道结构重塑等，能重塑机体致炎/抑炎平衡调控机制［17］；枸杞子中的枸杞多糖可调节Th 细胞失衡，发挥调节哮喘小鼠气道炎症作用［18］；补骨脂中的补骨脂总香豆素具有平喘作用［19］；地龙中的含氮成分黄嘌呤具有抑制支气管收缩，增加血管通透性，发挥平喘作用［20］。

综上所述，平喘固本膏可改善支气管哮喘患者临床症状，降低HMGB1及LTD4水平，升高cAMP水平，促使β2受体功能恢复，抑制炎症反应，调节免疫功能，可抑制支气管哮喘患者T淋巴细胞NF-κB活性是平喘固本膏升高支气管哮喘患者T 淋巴细胞源性IL-10 水平，抑制PPAR-γ-NF-κB 通路的机制之一。