三七皂苷R1对血小板衍生生长因子BB诱导内皮细胞增殖的影响

赵明慧，石 岩，吴 微，张紫腾，程冰冰，张新颖，王雅妹，秦 岩

(1.河北大学附属医院，河北 保定 071000；2.河北大学，河北 保定 071000)

血管新生是肿瘤运输营养物质得以迅速生长和远端转移的关键因素[1-2]。肿瘤血管新生是一个复杂调控的过程，其主要受到由肿瘤细胞、内皮细胞、细胞外基质、免疫细胞、成纤维细胞及血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)等各种生长因子共同构成的局部肿瘤微环境的影响[3-5]。其中内皮细胞是肿瘤血管新生的基础，在肿瘤新生的过程中关键的环节是内皮细胞功能发生了变化，导致促增殖基因转录激活，促凋亡基因沉默，并最终导致Akt等增殖信号通路的活化及细胞迁移进程的启动，所以内皮细胞的增殖与血管新生密切相关。因此，抑制内皮细胞的过度增殖可能成为肿瘤抗血管生成的治疗策略。中药三七性甘、温，味微苦，具有化瘀止血、活血定痛的功效，其主要成分有人参皂苷Rg1、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和三七皂苷R1(NR1)，NR1具有抗肿瘤生长、增强机体免疫功能等作用[6-9]，但是其抑制肿瘤生长是否与抑制内皮细胞增殖有关尚不明确。本研究初步探讨了NR1对内皮细胞EAhy926增殖的影响及其可能的作用机制。

1 实验材料和方法

1.1实验细胞 EAhy926购于美国ATCC库，由河北大学附属医院实验中心常规保存。

1.2药物 NR1(MCE公司，样品批号：80418-24-2，样品纯度≥97.0%)10 mg，使用DMSO溶解原液，储存浓度为100 mg/mL，过滤后保存于-80 ℃，使用时稀释为相应浓度。

1.3试剂与仪器 高糖DMEM培养基购于美国Gibco公司；胎牛血清FBS购自美国Gemini公司；青霉素和链霉素、异丙醇、氯仿、上样缓冲液、脱脂奶粉、DEPC水、磷酸盐缓冲液、蛋白裂解液RIPA购于上海碧云天生物技术有限公司；TRIzol购于Invitrogen公司。引物由上海生工公司合成；CyclinD1、PCNA、Bcl-2单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin 单克隆抗体和二抗购自美国Proteintech 公司；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司；细胞凋亡试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。ABI7300 PCR仪(美国ABI公司)，蛋白电泳仪、酶标仪(美国伯乐公司)，流式细胞仪Calibur(美国BD公司)，二氧化碳培养箱(美国ThermoFisher公司)，Olympus显微镜(日本Olympus公司)。

1.4实验方法

1.4.1细胞培养 在10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，处于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养EAhy926。

1.4.2细胞活力检测 实验分为6组：空白组常规培养，PDGF-BB组加入 PDGF-BB培养，PDGF-BB+10 μmol/L NR1组、PDGF-BB+20 μmol/L NR1组、PDGF-BB+40 μmol/L NR1组、PDGF-BB+80 μmol/L NR1组分别加入 PDGF-BB和相应浓度 NR1培养。分别于培养24 h和48 h时取各组细胞，以2×104/mL的密度、每孔100 μL接种于96孔板中，每组重复3次。放入37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h，加入含CCK-8溶液的完全培养基150 μL，在细胞培养箱内培养3 h，在波长450 nm处检测各组各孔的吸光值。

1.4.3细胞凋亡检测 分组同1.4.2，收集各组细胞，150×g离心5 min，弃上清，预冷的PBS洗涤3次。用500 μL PBS重悬细胞，按细胞凋亡试剂盒说明书操作加入Annexin V-FITC/PI 双标记，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，每组重复3次。

1.4.4细胞中CyclinD1、PCNA、Bcl-2蛋白表达Western blot 检测 实验分为3组：对照组常规培养，PDGF-BB组加入 PDGF-BB培养，PDGF-BB+NR1组加入 PDGF-BB和40 μmol/L NR1培养。培养24 h后取各组细胞，采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白并进行定量。每孔加入30 μg进行蛋白分离后转印至PVDF膜上，室温封闭2 h。加入兔抗人CyclinD1、PCNA、Bcl-2和β-actin单克隆抗体(体积稀释比例均为1∶1 000)4 ℃摇床过夜。次日10 min/次洗膜5次后加入二抗(体积稀释比例为1∶20 000)，孵育1 h。用TBST 10 min/次洗膜5次，使用化学发光成像仪进行发光，使用Image J进行灰度扫描分析，将目的蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处理。

1.4.5细胞中CyclinD1、PCNA、Bcl-2 mRNA表达qRT-PCR检测 实验分为3组：对照组常规培养，PDGF-BB组加入 PDGF-BB培养，PDGF-BB+NR1组加入 PDGF-BB和40 μmol/L NR1培养。培养24 h后取各组细胞，根据Total RNA试剂盒说明书提取细胞总RNA，反转录后以cDNA为模板，以18 S为内参，进行荧光定量PCR。引物序列：CyclinD1上游5’-GCCCGTGAGGCAGAGGCTGC-3’，下游5’-TGGTGAGGACGATTATGGCCC-3’；PCNA上游5’-CATCCCATGGTTCATCGTGGCTGAACT-3’，下游5’-GAAGTAGGTGAAGATGAAGAACAGAAC-3’；Bcl-2 上游5’-ATGGCAACTCTAAAGGATCA-3’，下游5’-GCAACTTGCAGTTCGGGC-3’；18 S上游5’-TGCGAGTACTCAACACCAACA-3’，下游5’-GCATATCTTCGGCCCACA-3’。各组均设3个复孔。以2-ΔΔCt法表示各目的基因的相对表达量。

1.5统计学方法 采用Graphad 8.0软件绘图并进行统计处理，组间两两比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组内皮细胞增殖情况 PDGF-BB组培养24 h和48 h细胞增殖率均明显高于空白组(P均<0.05)；PDGF-BB+20 μmol/L NR1组、PDGF-BB+40 μmol/L NR1组、PDGF-BB+80 μmol/L NR1组细胞增殖率均明显低于PDGF-BB组(P均<0.05)，且呈时间和剂量依赖性降低。见表1。

表1 空白组和各干预组内皮细胞增殖率比较

2.2各组内皮细胞凋亡情况 空白组、PDGF-BB组和PDGF-BB+10 μmol/L NR1组培养24 h和48 h细胞凋亡率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；PDGF-BB+20 μmol/L NR1组、PDGF-BB+40 μmol/L NR1组、PDGF-BB+80 μmol/L NR1组培养24 h和48 h细胞凋亡率均明显高于PDGF-BB组(P均<0.05)，且呈时间和剂量依赖性增高。见表2。

表2 空白组和各干预组内皮细胞凋亡率比较

2.3各组内皮细胞中CyclinD1、PCNA及Bcl-2蛋白表达情况 与对照组比较，PDGF-BB组CyclinD1、PCNA 蛋白表达量均明显增高(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表达量明显降低(P<0.05)；与PDGF-BB组比较，PDGF-BB+NR1组CyclinD1、PCNA 蛋白表达量均明显降低(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表达量明显增高(P<0.05)。见图1。

图1 各组内皮细胞中CyclinD1、PCNA及Bcl-2蛋白表达情况

2.4各组内皮细胞中CyclinD1、PCNA及Bcl-2 mRNA表达情况 与对照组比较，PDGF-BB组CyclinD1、PCNA mRNA表达量均明显增高(P均<0.05)，Bcl-2mRNA表达量明显降低(P<0.05)；与PDGF-BB组比较，PDGF-BB+NR1组CyclinD1、PCNA mRNA表达量均明显降低(P均<0.05)，Bcl-2mRNA表达量明显增高(P<0.05)。见图2。

图2 各组内皮细胞中CyclinD1、PCNA及Bcl-2 mRNA表达情况

3 讨 论

目前治疗肿瘤的西药存在耐药性和明显不良反应，寻找和探寻抗肿瘤的新型药物一直是研究的热点[10-11]。NR1是三七总皂苷中有效活性成分之一，其具有抗动脉粥样硬化、抑制肿瘤血管新生、提高免疫力等多系统的预防和治疗作用[12-15]。Qin等[16]报道，NR1能通过抑制细胞周期素D2(CCND2)和Y盒结合蛋白3(YBX3)的表达而发挥抑制乳腺癌细胞增殖作用。Wang等[17]和Zhu等[18]研究表明，NR1具有保护缺氧缺血神经和抗细胞凋亡的作用。Zhao等[19]研究发现，NR1可通过抑制XIST/miR-221-3p/TRAF6轴减轻低密度脂蛋白诱导的内皮细胞炎性和氧化应激反应。冯磊等[20]采用尾静脉注射HL-60细胞方法制备白血病小鼠模型，显示NR1能通过抑制VEGF表达及PI3K/AKT信号通路磷酸化而发挥抑制肿瘤细胞侵袭和迁移作用。但是NR1对内皮细胞增殖作用的机制研究尚未见报道。因此，本研究通过体外实验，探讨了NR1对内皮细胞(EAhy926细胞)增殖的影响及机制。

本研究细胞增殖和凋亡实验结果显示，PDGF-BB可诱导内皮细胞增殖；20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的NR1对细胞增殖有明显抑制作用，可诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖性。40 μmol/L的NR1作用24 h后对内皮细胞的增殖抑制率达50%，为了避免由于药物毒性造成的细胞死亡，因此选择该浓度和作用时间进行后续实验。

既往众多研究表明，CyclinD1和PCNA是细胞增殖和分化过程中的重要成员，二者的高表达可促进乳腺癌、肝癌、卵巢癌等多种肿瘤的进展[21-23]。细胞受到外界刺激信号，由Bcl-2家族主导引起的线粒体外膜通透性改变，促进凋亡相关小体的形成和Caspase家族级联的激活，诱导细胞凋亡[24-25]。本实验结果显示，PDGF-BB组内皮细胞中CyclinD1、PCNA 蛋白及mRNA 表达量较对照组明显上调，Bcl-2蛋白及mRNA表达量较对照组明显下调，说明PDGF-BB能够通过促进内皮细胞中促增殖的蛋白周期蛋白CyclinD1和细胞核增殖抗原PCNA的表达，抑制凋亡基因Bcl-2的表达而促进内皮细胞增殖；PDGF-BB+NR1组内皮细胞中CyclinD1、PCNA 蛋白及mRNA表达量较PDGF-BB组明显下调，Bcl-2 mRNA及蛋白表达量较对照组明显上调，说明NR1能够通过抑制PDGF-BB诱导的CyclinD1和PCNA表达，促进Bcl-2表达而诱导内皮细胞凋亡。

综上所述，PDGF-BB可促进内皮细胞增殖，NR1可抑制内皮细胞增殖并诱导内皮细胞凋亡，NR1可能对肿瘤抗血管新生的治疗具有重要作用，有待动物实验进行验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。