安肠汤对重症溃疡性结肠炎大鼠PKC/NF-κB/SOCS3通路及甘氨酸表达的影响

赖斯华，孙平良，欧海玲，梁运特，廖志远，张 琴，汤 勇

(1.广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

溃疡性结肠炎属于炎症性肠病，以慢性非特异性肠道炎症为特征，病变主要累及结肠和直肠[1]。溃疡性结肠炎病机复杂，尚缺乏长期有效的治疗药物，患者反复发病，影响生活，探讨该病发病机制及治疗方法一直是研究的热点。安肠汤是广西名老中医肖振球教授治疗溃疡性结肠炎的临床经验方，该方以脾肾阳虚立论，临床上用于治疗溃疡性结肠炎疗效显著[2-3]，但其作用机制尚有待明确。目前研究发现，在溃疡性结肠炎发病过程中，存在着核因子κB(NF-κB)蛋白通路的持续活化[4-5]。而蛋白激酶C(PKC)的激活能调控NF-κB核转移使其激活，导致NF-κB蛋白的高表达[6]，这一环节在SOCS3表达过程中起重要作用[7]。甘氨酸是一种非必需氨基酸，能干扰NF-κB的活化，可显著降低血清促炎细胞因子水平，增加抗炎细胞因子水平[8]。本实验主要通过观察安肠汤对重症溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中PKC、NF-κB、SOCS3表达和粪便、血浆中甘氨酸含量的影响，探讨该方治疗溃疡性结肠炎的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级6～8周Wistar大鼠72只，雌雄各半，体重(200±20)g，购于长沙天勤生物技术有限公司，合格证号：SCXK(湘)2014-0011，许可证号：SYXK(桂)2010-0001。实验大鼠采光昼夜交替(光照时间7:00—18:00)，自由饮食饮水，饲养环境保持温度25 ℃左右、湿度50%左右，通风良好，适应性喂养7 d。本实验研究经过广西中医药大学动物伦理委员会批准。

1.1.2实验药物 安肠汤(药物组成：熟附子15 g、干姜10 g、白术10 g、白头翁15 g、茯苓15 g、补骨脂25 g、黄芪20 g、党参15 g、槟榔15 g、鸡内金10 g、薏苡仁10 g、木香10 g、地榆15 g、赤芍15 g、玄胡索10 g、甘草10 g)，购于广西中医药大学第一附属医院仙葫院区药房，按处方取药材洗净、温水浸泡30 min，熟附子先煎30 min,倒入余药，水煎3次，浓缩至100 mL含生药量5 g水溶液，4 ℃保存备用；美沙拉嗪肠溶片,葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司生产,国药准字H19980149，用生理盐水配成5 mg/mL混悬液。

1.1.3主要试剂及耗材 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司)，水合氯醛、无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)，无菌生理盐水(上海晶都生物技术有限公司)，伊红染液(法国梅里埃公司)，Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time，RR047A)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus，RR082A)、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time，RR036A)，MonAmpTMSYBR®Green qRT-PCR Mix(Monad公司，High ROX，MQ10301)，TransScript®-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金公司，AU311)，0.2 mL荧光定量RT-PCR透明八排管八连管盖(ABI公司，4323032)，Solarbio公司的苏木精、TriQuick Reagent(R1100)、高效RIPA组织/细胞裂解液(R0010)、蛋白酶抑制剂混合液(100×PIC)(P6730)、4×Buffer(P1016)、BCA(PC0020)、脱脂奶粉(D8340)，Biosharp品牌的ECL化学发光底物(超敏)(BL523A)、PKC抗体(BL3531R)、NF-κB抗体(BL20355R)、p-NF-κB抗体(BL3440R)、SOCS3抗体、Actin，Goat anti-rabbit(美国 Abcam 公司，GR312354-1、ab8227、ab6721)，L-甘氨酸(标准品，meilunbio，MB4166-S)。

1.1.4主要仪器 PreviColor Gram革兰染色仪(法国梅里埃公司)，赛默飞Excelsior AS自动组织脱水机[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]，Leica HistoCore BIOCUT石蜡切片机(徕卡微系统有限公司)，Nikon50i显微图文系统(日本Nikon公司),组织匀浆机(德国IKA、T18)，恒温金属浴锅(上海一恒,TU-100C)，普通离心机(上海卢湘仪,TD4)，Haier医用低温保存箱(青岛海尔特种电器,DW-86L728J)，超微量核酸检测仪(遂真,FC-1100)，Ariamx Real-Time RT-PCR(Agilent Technologies，G8830-64001)，VeritiTM96-Well Thermal Cycler(Applied Biosystems®，4375786)，低温离心机(eppendorf、5418R)，多功能酶标仪(美国MD，FilterMax F3)，水平摇床(其林贝尔，TS-3D)，电泳仪(Bio-Rad，PowerPac Basic)，蛋白转印模块(湿转)(Bio-Rad，Mini Trans-Blot Cell)，凝胶成像系统(上海天能，Tanon 5200)，台式恒温培养振荡器摇床(空气)(上海智诚，ZWYR-2102C)，高效液相色谱仪(Shima-dzu，LC30AD)，Hypersil GOLD HILIC C18 色谱柱(Thermo，100×2.1 mm×1.9 μm)。

1.2实验方法 将72只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、美沙拉嗪组及安肠汤低、中、高剂量组，每组12只。在禁食不禁饮24 h后，用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹部皮内注射进行麻醉后，将导尿管缓缓插入大鼠肛门7 cm，注入50 mg/kg的2，4，6-三硝基苯磺酸液+等容积的50%乙醇溶液，使药液缓慢进入肠道，将大鼠提尾倒置2 min，让药液充分停留在结肠内，待大鼠清醒后少量饮食、进水。继续禁食不禁饮24 h,上述造模方法重复2次，共连续3 d。造模后第7天开始，美沙拉嗪组给予5 mg/mL美沙拉嗪混悬液0.35 mL灌胃，安肠汤低、中、高剂量组分别给予50 mg/mL安肠汤0.53 mL(相当于临床用药0.5倍量)、1.1 mL(相当于临床用药等效量)、3 mL(相当于临床用药3倍量)灌胃，空白组和模型组给予生理盐水灌胃，每只灌胃量均为3 mL，每日1次，连续7 d。

1.3检测指标及方法

1.3.1大鼠一般情况 观察各组大鼠造模后及灌胃后临床表现，记录各组大鼠死亡情况及体重。

1.3.2病情严重程度 分别于造模第7天和灌胃第7天，采用疾病指数评分(DAI评分)[8]评估大鼠病情严重程度，DAI评分=(体重下降计分+大便性状计分+大便便血情况计分)/3，DAI评分越高提示病情越严重。粪便隐血情况采用隐血试纸测试。

1.3.3标本采集、处理 灌胃第7天次日禁食24 h后处死各组大鼠，无菌环境下取肠系膜下静脉血5 mL，3 000 r/min离心2 min，取血浆于EP管中，迅速予液氮速冻，其后转至-80 ℃冰箱保存。取各组大鼠病变结肠段粪便5～10 g于EP管，用液氮速冻后存至-80 ℃冰箱。取出结肠，于冰上操作，沿肠系膜缘剪开肠腔，用细胞保护液清洗肠黏膜表面粪便，用于病理检测部分放于细胞固定液中；余放置于冻存管，液氮速冻，转至-80 ℃冰箱存放。

1.3.3.1结肠组织病理观察 将组织样本脱水处理，经包埋、蜡块凝固、切片、捞片，烤片过夜，次日经切片脱蜡水化，苏木、伊红染色，脱水封片，光学显微镜下观察拍照。

1.3.3.2结肠组织中PKC、NF-κB、p-NF-κB、SOCS3蛋白表达检测 采用Western blot法检测：用无菌剪刀把各样品组织剪成细小的碎片，取40 mg置于冰盒上的2 mL离心管中，加400 μL RIPA-PMSF-PIC后用匀浆机匀浆，匀浆5 s放回冰盒冷却再继续，无沉淀后停止。12 000 r/min离心5 min后取上清液，BCA法测定蛋白含量。将浓度定量至2 μg/μL，加4×蛋白上样buffer，100 ℃变性10 min。90 V恒压电泳约20 min，待分离胶层有样品进入后，换120 V恒压电泳1～1.5 h。300 mA恒流转膜90 min。用TBST配8%脱脂奶粉配置封闭液。将膜放入封闭液中3 h。按说明书上的比例将一抗用封闭液稀释，把膜放入稀释后的一抗中，4 ℃冰箱孵育12 h后用TBST洗膜3次，每次15 min。将膜放入按1∶4 000比例稀释，在37 ℃条件下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min。用ECL显色剂对膜显色，曝光成像放入凝胶成像仪中。利用Image J软件计算条带的灰度值。

1.3.3.3结肠组织中PKC、NF-κB、SOCS3mRNA表达检测 采用RT-PCR法检测：采用Solarbio公司TriQuick Reagent总RNA提取试剂盒按说明提取总RNA后，取1 μL的RNA样本，用超微量核酸检测仪直接测定A260/280比值的RNA浓度，若比值在1.7～2.1之间的RNA纯度较好，否则重新提取。试剂5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)4 μL、Total RNA 1 μg、RNase Free dH2O 20 μL，可根据反应体系加大需求量，反转录反应结束后得到cDNA模板；根据所需检测的样本和基因数量，配制好所有PCR反应体系(单样本单基因)，SYBR Premix Ex Taq(Ti RNaseH Plus)(2×)7.5 μL、primer-F 0.6 μL、primer-R 0.6 μL、cDNA 模板1 μL、dH2O 5.3 μL，设定反应程序，检测反应体系中的荧光强度检测所需基因的表达量。记录每个样本所对应基因的Ct值并算出均值，最后算出每个样本目的基因mRNA的相对表达量为目的基因的2-△△ct。引物序列见表1。

表1 结肠组织中PKC、NF-κB、p-NF-κB、SOCS3mRNA表达RT-PCR检测引物序列

1.3.3.4血浆及粪便中甘氨酸含量检测 采用液相色谱法检测：①取500 μL血浆,加入1 500 μL乙腈，混匀后12 000 r/min离心10 min，取上清，离心浓缩后，使用300 μL乙腈溶解浓缩析出物，溶液经0.22 μm滤膜过滤后进行上机检测。②取粪便样本100 mg，加入1 mL乙腈，于低温状态下进行超声波破碎处理，震荡混匀后12 000 r/min离心10 min，取上清，再次离心以去除内部沉淀物，取上清溶液经0.22 μm滤膜过滤后进行上机检测。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 大鼠造模后逐渐出现精神萎靡、懒动、弓背、扎堆，毛发色泽暗淡发黄，继而出现腹胀，体重下降，出现肉眼黏液脓血便和稀水样黄便、黑便；造模第7天，模型组、美沙拉嗪组及安肠汤低、高剂量组各死亡3只，安肠汤中剂量组死亡4只。灌胃第7天，模型组存活6只，美沙拉嗪组及安肠汤低、高剂量组各存活7只，安肠汤中剂量组存活8只，各药物组存活大鼠精神状态好转，其中美沙拉嗪组血便减少，但是部分仍腹泻，体重逐渐恢复；安肠汤中剂量组部分大鼠出现成形较黏性的大便，血便明显减少，体重缓慢恢复，由于安肠汤味苦，部分大鼠灌胃后呕吐，尤其安肠汤高剂量组反应大。实验全程雌性大鼠、体重较轻大鼠死亡较多。

2.2各组大鼠DAI评分 空白组大鼠实验期间DAI评分为0分；造模第7天，各造模组大鼠的DAI评分均明显增高，各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；灌胃第7天，各药物组大鼠的DAI评分均明显低于造模第7天及模型组(P均<0.05)，且美沙拉嗪组和安肠汤中剂量组均明显低于安肠汤低剂量组(P均<0.05)，安肠汤中剂量组明显低于安肠汤高剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组重度溃疡性结肠炎大鼠造模及灌胃后DAI评分比较分)

2.3各组大鼠结肠组织HE染色情况 空白组大鼠结肠黏膜表面未见糜烂，细胞排列整齐；模型组大鼠结肠黏膜糜烂、破溃，细胞排列紊乱；各药物组大鼠结肠黏膜损伤均有好转，其中安肠汤中剂量组、美沙拉嗪组恢复最佳，安肠汤低、高剂量组相对较差。见图1。

图1 空白组和重度溃疡性结肠炎各组大鼠结肠组织HE染色情况(×10)

2.4各组大鼠结肠组织中PKC、NF-κB、p-NF-κB、SOCS3蛋白表达情况 模型组大鼠结肠组织中PKC、NF-κB、p-NF-κB、SOCS3蛋白表达量均明显高于空白组(P均<0.05)；各药物组大鼠结肠组织中PKC、NF-κB、p-NF-κB、SOCS3蛋白表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，且安肠汤中、高剂量组PKC、p-NF-κB蛋白表达量和安肠汤高剂量组NF-κB蛋白表达量均明显低于安肠汤低剂量组(P均<0.05)，安肠汤低、中剂量组间NF-κB蛋白表达量和各药物组间SOCS3蛋白表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2及表3。

表3 空白组和重度溃疡性结肠炎各组大鼠结肠组织中PKC、NF-κB、SOCS3蛋白相对表达量比较

图2 空白组和重度溃疡性结肠炎各组大鼠结肠组织中PKC、NF-κB、SOCS3蛋白表达条带

2.5各组大鼠结肠组织中PKC、NF-κB、SOCS3mRNA表达情况 模型组大鼠结肠组织中PKC、NF-κB、SOCS3mRNA表达量均明显高于空白组(P均<0.05)；各药物组大鼠结肠组织中NF-κB、SOCS3 mRNA表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，PKC mRNA表达量均高于模型组(P均<0.05)；安肠汤中、高剂量组PKC、NF-κBmRNA表达量和安肠汤高剂量组SOCS3mRNA表达量均明显低于安肠汤低剂量组(P均<0.05)，安肠汤中、高剂量组间PKC、NF-κB、SOCS3mRNA表达量和安肠汤低、中剂量组间SOCS3mRNA表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 空白组和重度溃疡性结肠炎各组大鼠结肠组织中PKC、NF-κB、SOCS3mRNA表达量比较

2.6各组大鼠血浆和粪便中甘氨酸浓度 模型组大鼠血浆及粪便中甘氨酸浓度均明显高于空白组(P均<0.05)；各给药组大鼠血浆及粪便中甘氨酸浓度均明显低于模型组(P均<0.05)，美沙拉嗪组和安肠汤中、高剂量组血浆及粪便中甘氨酸浓度均明显低于安肠汤低剂量组(P均<0.05)，安肠汤中、高剂量组间血浆及粪便中甘氨酸浓度比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；各组大鼠粪便中甘氨酸浓度均明显高于血浆中甘氨酸浓度(P均<0.05)。见表5。

表5 空白组和重度溃疡性结肠炎各组大鼠血液和粪便中甘氨酸浓度比较

3 讨 论

溃疡性结肠炎作为一种反复发作的慢性非特异性肠道炎症性疾病，其病程长、缠绵难愈，严重影响患者健康和生活质量。目前尚无长期有效的治疗药物，针对溃疡性结肠炎发病机制的研究和中医药治疗至关重要。安肠汤中熟附子、干姜为君，温补脾肾；黄芪、党参、茯苓、白术补气为臣，气能生血，改善患者长期黏液血便的失血；佐以补骨脂助君药温肾助阳、温脾止泻；白头翁祛湿止痢，鸡内金、地榆凉血止痢；薏苡仁利水渗湿，健脾止泻；赤芍活血散瘀止痛；玄胡索、木香行气止痛；槟榔行气止泻，起行气排水之用；甘草调和诸药。纵观全方，具有补脾温肾、健脾益气、活血化瘀、利水渗湿、行气导滞之功效，切中溃疡性结肠炎病机。

NF-κB蛋白是一种多功能的核转录因子，是多种信号传导途径的汇聚点，其在炎症的调控中起着关键性作用[4，9]。PKC是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，具有不同的功能和组织分布，参与细胞分化、增殖、凋亡或细胞运动等多种重要的分子过程，可激活NF-κB蛋白通路[10-11]。PKC参与磷脂酰肌醇二甘露醇(PIM2)诱导SOCS3表达过程，可使NF-κB p65核转移[12]。Li等[13]报道，溃疡性结肠炎复发与SOCS3的高表达有关。因此，PKC/NF-κB/SOCS3通路的表达与溃疡性结肠炎息息相关。本实验证实，TNBS+乙醇致重症溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中存在PKC、NF-κB、SOCS3蛋白和mRNA高表达，安肠汤干预能促进PKC mRNA表达，抑制PKC蛋白及NF-κB、SOCS3蛋白和mRNA表达，促进病变结肠黏膜的恢复。安肠汤干预后PKC蛋白和mRNA表达不一致，考虑基因经过转录-翻译成蛋白，以及翻译后修饰的过程中mRNA可被利用多次，或者存在一条mRNA被翻译几次，也可能有非编码RNA的参与。

本课题组既往研究发现，溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜中苏氨酸浓度降低、甘氨酸含量升高[14]。甘氨酸可以激活细胞膜上L型电压依赖性钙通道的开放[15]，可致细胞膜上Ca2+减少，影响Ca2+依赖的PKC，PKC能使苏氨酸磷酸化，使苏氨酸的含量减少。本实验用液相色谱法检测发现重症溃疡性结肠炎大鼠血浆和粪便中甘氨酸浓度升高，证实甘氨酸可作为诊断溃疡性结肠炎的标志物；安肠汤干预后，溃疡性结肠炎大鼠血浆、粪便中甘氨酸浓度明显降低。提示安肠汤可能通过降低甘氨酸浓度，抑制PKC蛋白表达，进一步影响PKC下游的NF-κB和SOCS3表达，从而减轻炎症反应。

综上所述，PKC/NF-κB/SOCS3及甘氨酸在溃疡性结肠炎的发病中起到了重要作用；安肠汤可能通过降低溃疡性结肠炎大鼠血浆和粪便甘氨酸的浓度，影响PKC/NF-κB/SOCS3通路相关因子的表达而促进结肠黏膜损伤修复。后期课题组将以此为基础，从代谢产物及免疫学方面进一步探讨安肠汤治疗溃疡性结肠炎的机制。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。