基于“免疫-炎症”环节探究小柴胡汤“异病同治”系统性红斑狼疮和肾小球肾炎的作用机制

常梦丽，郭非非，唐仕欢，杨洪军

中国中医科学院中药研究所，北京 100700

辨证论治是中医诊疗的特色和精髓，异病同治是中医辨证论治方法的具体体现。运用现代科技手段揭示异病同治的生物学基础及其作用原理是中医现代化研究中的关键之一，也是进一步阐述辨证论治这一科学内涵的重要部分。小柴胡汤出自《伤寒杂病论》，由柴胡、黄芩、人参、半夏、生姜、甘草、大枣等七味药组成，具有和解少阳的功效。中医临床随证加减可广泛用于多种疾病的治疗，实现异病同治，如2型糖尿病、肺癌、亚急性甲状腺炎及慢性乙型肝炎肝纤维化等[1-4]。此外，对感染性疾病如细菌性肝脓肿及小儿呼吸道感染也具有较好的临床疗效[5,6]。临床报道表明，对免疫系统疾病患者如系统性红斑狼疮和肾小球肾炎患者，小柴胡汤能显著改善其免疫指标，恢复正常免疫状态[7,8]。现代药理证实，小柴胡汤可通过调节免疫、抗炎、调节内分泌、抗肝纤维化及抗肿瘤等多个途径作用于不同的疾病环节发挥药效作用[9]。在这些作用环节中，小柴胡汤对免疫功能的调节和对炎症反应的干预可能是其共性基础[1,10,11]。

通过前期的研究，课题组已构建了基于网络稳健性的中药药效预测平台(http://47.92.232.154:100/)，该平台可以实现模拟单味药材、中药复方及药物靶点对疾病网络的干预，具体实现过程是通过删除疾病的网络节点来模拟药物对于疾病的扰动作用。删除同一个疾病网络不同的节点会导致网络结构发生不同的变化，网络的稳定性也不同，药物对于疾病的干预目的在于最大限度影响网络的稳定性和破坏网络的结构。通过比较药物干预前后网络拓扑特征的变化使用扰动率来评价药物对于疾病的干预作用。此外，通过构建随机的网络，模拟删除节点对于随机网络稳健性影响的总体分布(permutation test)来考察药物对于真实网络扰动处于总体分布的位置，并通过计算校正后的扰动率来客观评价药物对于真实网络的扰动强度[12,13]。以新型冠状病毒肺炎为范例，该平台已实现常用经典名方治疗新型冠状病毒肺炎的潜在作用分析，为新型冠状病毒肺炎的有效药物筛选提供了可靠参考[14]。

基于前期基础，为探究小柴胡汤治疗疾病的作用机制及具体环节，本研究以免疫系统疾病系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)和肾小球肾炎(glomerulonephritis，GN)为范例，基于基因表达综合(gene expression omnibus，GEO)数据库获取SLE和GN疾病相关的差异基因构建疾病网络，运用中药药效预测分析平台分析小柴胡汤对两种疾病的干预情况，并通过与上市西药对疾病网络的干预对比来验证疾病模型的可靠性，随后进行GO分析和KEGG分析，从“免疫-炎症”的角度揭示小柴胡汤异病同治的机理。

1 方法

1.1 SLE与GN的疾病网络构建

以疾病英文名即“systemic lupus erythematosus”与“glomerulonephritis”为关键词在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)公共数据库搜集SLE与GN疾病患者的基因表达谱数据，筛选条件如下：物种为人、每个ID须包含健康对照组、每组样本数均≥3，取材部位一致，不包含小RNA的数据等。基于GEO2R工具在线分析得到差异基因，设置筛选条件为log2FC≥1或≤-1(差异表达上调或下调2倍以上)且P<0.01，最终将出现在2个以上GSE数据集中的基因作为所得差异基因的结果。将筛选得到的差异基因导入String(https://www.string-db.org)平台构建差异基因可能的相互作用关系图，并将此作用关系图导入Cytoscape 3.8.0进行拓扑分析，以2倍degree中位数为条件筛选得到核心Hub网络，以“degree”“closeness”和“betweenness”中位数为卡值筛选得到核心靶点，以此作为核心疾病基因上传至中药药效预测平台构建疾病网络。

1.2 基于中药药效预测平台的药物扰动评分

基于中药药效预测平台(http://47.92.232.154:100/)进行小柴胡汤对SLE与GN疾病网络的扰动。具体操作如下：选择输入药材进行靶标预测，输入小柴胡汤药材拼音名；选择要干预的疾病网络即SLE与GN疾病网络；设定疾病网络中蛋白质相互作用的卡值为0.5，设定分析参数p.adjust为0.5、富集比为3；点击提交。

1.3 方法学验证

基于文献报道搜集临床常用的用于治疗SLE与GN的上市西药，通过ChEMBL数据库(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)获得上市西药的成分信息[15]，并搜集药物的靶点，基于中药药效预测平台进行上市西药对疾病网络的扰动。具体操作如下：选择输入药物自定义靶标，输入每个西药的前250个靶点，选择自定义网络，手动输入节点，输入自定义网络名称以及自定义网络中的节点即最终得到的疾病关键靶点；设定疾病网络中蛋白质相互作用的卡值为0.5；设定分析参数p.adjust为0.5、富集比为3；点击提交。利用z-Score模型将小柴胡汤对疾病的扰动评分进行校正，模拟与上市西药的药效对比。

1.4 GO功能富集分析与KEGG通路分析

利用metascape(http://metascape.org/gp/index.html)进行疾病网络基因的生物学过程(biological process，BP)分析并将疾病网络可视化，利用Cytoscape 3.8.0中的ClueGO插件，通过输入小柴胡汤干预SLE与GN疾病的潜在靶点及共同靶点，设置物种为“homo sapiens”，阈值P≤0.05，进行GO分析和KEGG分析。

2 结果

2.1 SLE与GN疾病网络可视化

基于GEO公共数据库，按照上述步骤搜集、分析并筛选，最终到SLE患者的皮肤4个样本数据集GSE148810、GSE109248、GSE95474、GSE81071，GN患者肾脏的12个疾病样本数据集GSE116626、GSE115857、GSE133288、GSE108112、GSE108109、GSE104066、GSE113342、GSE93798、GSE32591、GSE35488、GSE35487、GSE104948。通过差异基因分析并选择在至少2个研究ID内出现的基因，最终得到SLE相关的714个差异基因、GN相关的1 293个差异基因。通过蛋白互作分析及筛选得到SLE核心网络的95个差异基因和GN核心网络的112个差异基因，以此作为最终的疾病网络基因上传至中药药效预测平台用于后续分析。利用metascape进行疾病基因的GO富集分析，发现SLE疾病网络主要集中在先天性免疫应答的调节、适应性免疫应答、I型干扰素信号通路、淋巴细胞活化、白细胞迁移、B细胞增殖、参与免疫应答的白细胞活化、STAT级联、B细胞增殖等生物学功能(见图1)；GN疾病网络主要集中在免疫效应过程的调节、细菌和病毒的应答、细胞因子的生成、白细胞的迁移和分化、细胞因子-细胞因子受体相互作用、ERK1和ERK2级联反应、细胞死亡的正调节等生物学功能(见图2)；且二者疾病网络生物学功能均富集在对细菌的反应、白细胞迁移、对γ-干扰素的反应、细胞因子生成的调节等条目。

图1 SLE疾病网络中的节点参与的生物学功能

图2 GN疾病网络中的节点参与的生物学功能

2.2 上市西药与小柴胡汤对疾病网络的扰动评分

通过文献检索发现，临床用于治疗SLE的常用药物按照药理作用主要分为3类，分别是激素类、免疫抑制剂及抗疟药类[16-18]，本文选择抗疟药氯喹，激素类药物氢化可的松、可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松等，免疫抑制剂环磷酰胺、来氟米特、甲氨蝶呤、他克莫司、硫唑嘌呤等。临床用于治疗GN的常用药物按照药理作用主要分为6类，分别抗病毒药类、激素类、免疫抑制剂类、利尿剂、降血压药类、抗凝药类[19,20]。本文选择抗病毒药利巴韦林、青霉素G，激素类药物泼尼松、泼尼松龙、甲基波尼松、地塞米松，免疫抑制剂环磷酰胺、他克莫司、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥，利尿剂甲苯喹唑磺胺、氯噻酮，降血压药缬沙坦，抗凝药类华法林、阿司匹林等。基于中药药效预测平台进行上市西药对SLE、GN疾病网络的扰动评分并按照扰动打分值进行排序(见表1、2)。小柴胡汤中，大枣和甘草作为佐使药，其主要作用为调和药性，且基于平台算法，考虑到大枣和甘草会影响小柴胡汤对疾病网络的扰动评分，并不能真实反映小柴胡汤中君药、臣药对疾病网络的扰动情况，因此本文只分析小柴胡汤中除甘草、大枣外的药材即柴胡、黄芩、人参、半夏、生姜、药对(柴胡、黄芩)和组方(柴胡、黄芩、半夏、人参、生姜)对疾病网络的扰动情况，且阳性药的设置也可为小柴胡汤中的各个药材对疾病网络的扰动评分提供参考和对照。

表1 上市西药对SLE疾病网络的扰动评分

z值(z-Score)又称标准分数(standard score)，用公式表示为：z=(x-μ)/σ(x为某实测值，μ为平均数，σ为标准差)。可将两组或多组数据转化为无单位的z-Score分值，使得数据标准统一化，将不同量级的数据转化为统一量度的z-Score分值进行比较。z值代表实测值和总体平均值之间的距离，以标准差为单位计算，大于平均数的实测值会得到一个正数的z值，小于平均数的实测值会得到一个负数的z值。

以上市西药对疾病网络的扰动评分值为总体，小柴胡汤对疾病网络的扰动评分为实测值，通过计算z-Score值进行比对。正数代表小柴胡汤对疾病网络的扰动优于上市西药，负数表示上市西药对疾病网络的扰动优于小柴胡汤。将小柴胡汤干预疾病网络的数据按照扰动评分进行排序(见表3、4)。结果显示，黄芩、柴胡、生姜单味药材对SLE疾病网络的扰动评分优于上市西药，组方(柴胡、黄芩、半夏、人参、生姜)对SLE疾病网络的扰动略差于上市西药，黄芩、生姜、人参、柴胡、药对(柴胡、黄芩)、组方(柴胡、黄芩、半夏、人参、生姜)、半夏对GN疾病网络的扰动均优于上市西药，综合分析结果说明小柴胡汤具有异病同治SLE与GN的作用。

2.3 GO分析和KEGG分析

将小柴胡汤干预SLE疾病网络的82个潜在靶点，小柴胡汤干预GN疾病网络的77个潜在靶点分别导入Cytoscape 3.8.0中的ClueGO插件进行GO分析和KEGG分析，只保留满足P<0.05的条目，结果如图3、4、5、6所示，相同颜色代表同类的生物过程和信号通路，显著性最高的结果用彩色颜色字体注释，以上图中只显示具有显著性意义的结果，小柴胡汤干预SLE与GN的靶点交集Venn图如图7所示。

图3 小柴胡汤干预SLE疾病网络的潜在靶点的GO分析

图4 小柴胡汤干预SLE潜在靶点的KEGG分析

图5 小柴胡汤干预GN疾病网络的潜在靶点的GO分析

图6 小柴胡汤干预GN潜在靶点的KEGG分析

图7 小柴胡汤干预SLE与GN疾病潜在靶点的交集Venn图

表2 上市西药对GN疾病网络的扰动评分

表3 小柴胡汤对SLE疾病网络的扰动评分并经z-Score规范化

表4 小柴胡汤对GN疾病网络的扰动评分并经z-Score规范化

GO分析结果显示小柴胡汤治疗SLE的作用机制可能与淋巴细胞增殖(lymphocyte proliferation)、适应性免疫应答的调节(regulation of adaptive immune response)、细胞因子生物合成过程(cytokine biosynthetic process)、白细胞增殖调节(regulation of leukocyte proliferation)、细胞因子受体活性(cytokine receptor activity)、I型干扰素信号通路(type I interferon signaling pathway)、病毒应答(response to virus)、先天性免疫应答(innate immune response)等生物过程相关，参与的主要信号通路主要是原发性免疫缺陷(primary immunodeficiency)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、Toll样受体信号通路(toll-like receptor signaling pathway)、Th1和Th2细胞分化(Th1 and Th2 cell differentiation)、NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)、JAK-STAT信号通路(JAK-STAT signaling pathway)、B细胞受体信号通路(B cell receptor signaling pathway)等与免疫系统及炎症反应相关的信号通路。

小柴胡汤治疗GN的作用机制可能与模式识别受体信号通路(pattern recognition receptor signaling pathway)、白细胞介导的免疫调节(regulation of leukocyte mediated immunity)、神经炎症反应(neuroinflammatory response)、病毒应答(response to virus)、胶质细胞生成(glial cell development)、细胞因子分泌负调控(negative regulation of cytokine secretion)、ERK1和ERK2级联调控(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)等为代表的生物过程相关，其中以模式识别受体信号通路、白细胞介导的免疫调节等为例的免疫和炎症反应相关的生物过程占比最高；参与的信号通路主要包括甲型流感(influenza A)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、胞质DNA感应通路(cytosolic DNA-sensing pathway)、军团菌病(Legionellosis)、NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)等。

小柴胡汤异病同治SLE与GN共有38个交集靶点，按照上述步骤对这38个靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析，结果如图8、9所示，交集靶点见图10交集靶点的生物过程和KEGG通路交集见表5。GO分析结果显示小柴胡汤异病同治的作用机制可能与细胞因子生物合成过程的正调控(positive regulation of cytokine biosynthetic process)、α-干扰素生成的正调控(positive regulation of interferon-alpha production)、髓样白细胞分化调节(regulation of myeloid leukocyte differentiation)、神经炎症反应(neuroinflammatory response)、细胞因子受体活性(cytokine receptor activity)等生物过程相关，所参与的信号通路主要是胞质DNA感应通路(cytosolicDNA-sensing pathway)、人类对结核病的免疫反应(human immune response to tuberculosis)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)、STAT3信号通路的调节回路(regulatory circuits of the STAT3 signaling pathway)、IL-3信号通路(IL-3 signaling pathway)等。

表5 SLE、GN、SLE与GN交集靶点三者分析的生物过程和KEGG通路交集

图8 小柴胡汤异病同治SLE与GN交集靶点的GO分析

图9 小柴胡汤异病同治SLE与GN交集靶点的KEGG分析

图10 小柴胡汤干预SLE与GN的38个交集靶点

3 讨论

SLE和GN均为免疫系统异常导致的疾病，基于GEO数据库筛选发现SLE的靶器官众多：皮肤、肾脏、呼吸系统、心血管、神经系统和胃肠道等且致病因素复杂。二者的发病机制均涉及遗传、免疫系统的异常、炎症反应等[19,21]。小柴胡汤干预SLE与GN及二者的交集靶点的GO分析和KEGG分析结果与免疫炎症密切相关，如病毒过程的负调控、干扰素-β生成、对γ-干扰素的反应、细胞对γ-干扰素的反应、淋巴细胞增殖负调控、细胞因子生物合成过程的正调控、B细胞增殖调节、I型干扰素信号通路、干扰素γ介导的信号通路等生物过程，且可能是通过参与胞质DNA感应通路、NOD样受体信号通路、B细胞受体信号通路等信号通路介导的。

SLE的GO分析和KEGG分析结果显示小柴胡汤可能通过参与淋巴细胞增殖、适应性免疫应答的调节、细胞因子生物合成过程等生物过程发挥治疗作用，而相关的信号通路包括同种异体移植物排斥、EB病毒感染、原发性免疫缺陷、Toll样受体信号通路、Th1和Th2细胞分化等。同种异体移植物排斥会引起免疫系统的细胞免疫和体液免疫，主要免疫细胞是巨噬细胞，通过分泌炎症效应因子，增强适应性免疫应答，参与急性和慢性排斥反应[22]。EB病毒是一种DNA病毒，其主要靶器官除了B细胞和上皮细胞外，还会感染T细胞、NK细胞和平滑肌细胞并具有致瘤的能力[23]。Toll样受体信号通路在SLE的发病过程中发挥重要作用，研究表明，小鼠皮肤外用Toll样受体7(TLR7)激动剂可诱导SLE疾病，出现肾小球肾炎等自身免疫性疾病导致的器官损害[24]。

GN的GO分析和KEGG分析结果显示小柴胡汤可能通过参与模式识别受体信号通路、白细胞介导的免疫调节、白细胞增殖调节、神经炎症反应等与免疫和炎症相关的生物过程介导甲型流感、TNF信号通路、胞质DNA感应通路、军团菌病(Legionellosis)、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路等信号通路实现治疗。干扰素(IFN)信号通路是天然免疫的主要组成部分，在宿主抵抗病原体中发挥重要作用，临床研究发现活跃性SLE患者血液中单核细胞与干扰素调节和粒细胞生成相关的特定基因高表达，可通过抑制IFN表达发挥缓解疾病进程的作用[25]。

数据分析显示小柴胡汤异病同治SLE和GN可能是通过细胞因子生物合成过程的正调控、髓样白细胞分化调节、对γ-干扰素的应答以及α-干扰素生成的正调节等生物过程发挥作用，与胞质DNA感应通路、NOD样受体信号通路、人类对结核病的免疫反应、小胶质细胞病原体吞噬作用通路等免疫炎症类的信号通路密切相关。其中，胞质DNA感应通路，哺乳动物细胞质中存在的DNA通过结合到一种名为cGAS的二聚体酶上，这种结合触发一种酶促反应，导致一种环状信号分子形成，进而会诱导被称作干扰素的免疫刺激蛋白合成，因此触发强大的先天免疫反应产生[26]，且胞质内不能及时清除的DNA会通过激活细胞内的抗病毒反应，参与SLE及Aicardi-Goutieres综合征的发生[27]；NOD样受体主要包括NOD1和NOD2，NOD1和NOD2通过其富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats，LRRs)识别细菌成分，并通过下游效应器介导NF-κB的激活，使促炎细胞因子释放，在细胞的炎症反应、免疫应答和应激反应等过程中起关键作用[28,29]。

本文分析结果中T/B细胞功能和信号、NF-κB信号通路和I型干扰素信号通路等与临床研究中SLE及GN的潜在发病机制一致[30]，已获得批准上市的治疗SLE的药物贝利木单抗(Belimumab)是B细胞激活因子(B-cell activating factor，BAFF)的抑制性单克隆抗体[31]，BAFF可促进B细胞成熟和分化，与自身免疫密切相关，在免疫应答中起重要作用。干扰素诱导的GTP结合蛋白MX1，它的靶标病毒包括负链RNA病毒和HBV[32]，临床研究中MX1可作为诊断外周血SLE以及肾脏中狼疮性肾炎活动的潜在标志物[33]。通过分析发现I型干扰素信号通路、病毒过程的负调控、对γ-干扰素的反应、干扰素γ介导的信号通路、淋巴细胞增殖负调控、干扰素-β生成(interferon-beta production)、B细胞增殖调节等生物过程和胞质DNA感应通路(cytosolic DNA-sensing pathway)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)、甲型流感(influenza A)等信号通路均出现在小柴胡汤干预SLE、小柴胡汤干预GN、小柴胡汤干预SLE与GN的交集靶点的GO分析和KEGG分析结果中(见表5)，说明小柴胡汤异病同治的潜在机制可能与这些密切相关，未来仍需进一步深入研究。

本文仍存在不足之处，本文采用的中药药效平台仍需进一步完善，目前还无法考虑到中药靶点对于疾病靶点的作用强度问题，对于甘草、大枣等成分靶点较多的中药，纳入后会干扰方中主药对疾病网络的扰动结果，因此对疾病靶点的预测中去掉了甘草、大枣这两味药。

综上所述，基于药效预测分析和生物信息学方法，本文以小柴胡汤“异病同治”SLE和GN为范例，对柴胡类方异病同治的作用机理进行了系统分析，证实小柴胡汤可通过作用于“免疫-炎症”相关的疾病环节发挥治疗SLE和GN的作用，可为今后深入研究小柴胡汤“异病同治”的作用机制提供参考和借鉴，为解释中药复方在疾病中的干预环节和作用机制奠定基础。