宁夏枸杞果皮蜡质微形态及蜡质组分研究

马 洁，胡永超，岳艺彤，杨淑娟，杨 涓，郑国琦

(宁夏大学 生命科学学院，银川 750021)

宁夏枸杞是中国重要的药用植物资源，其干燥果实为中药“枸杞子”。宁夏枸杞果实属浆果类，其鲜果采后易发生霉变和难以制干，主要原因是其果实含水率高(湿基含水率达80%)，而且表皮上有一层蜡质层覆盖，致使内部水分难以排出，延长了制干时间且增加了霉变的发生。枸杞外果皮的表面由表皮层和角质化的皮下层组成，角质层上由蜡被覆盖，由于表皮细胞和蜡被的保护，枸杞果实才可正常生长、发育、成熟。但表皮细胞和蜡被的存在阻碍了果实内水分的蒸发，使枸杞鲜果不易制干[1]。为了缩短枸杞制干时间，前人已通过促干剂破坏枸杞表皮蜡质和角质层的完整性，使水分快速蒸发，进而提高干燥效率。

果实角质层主要由角质基质和覆盖并嵌入其中的蜡质两部分组成[2]，植物表皮蜡质为能溶于有机溶剂不溶于水的一层晶体结构，主要由超长链脂肪酸及其衍生物组成的有机混合物构成。它不仅在植物抵抗生物和非生物逆境中发挥重要作用，还对植物生长发育具有重要影响。目前关于果实表皮蜡质的研究主要集中在蜡质的结构[3-5]、含量[6-7]、组分[8-10]、生物合成[11-12]、功能[13-15]和形成的相关转录因子[16-18]等方面且多为模式植物，但关于枸杞果皮蜡质的相关研究屈指可数。杨爱梅等[19]以正己烷为溶剂对枸杞表皮蜡质进行浸提，通过GC-MS分析共检测出44个化合物，鉴定了39种成分，其中长链脂肪烃类化合物被确定是枸杞表皮蜡质层的主要成分；同时枸杞果实表皮蜡质层厚，呈排列紧密的光滑束状条带。杜静[1]的研究也表明，枸杞果皮蜡质层的主要组分为长链脂肪烃类物质(占总组分58.19%)，蜡质层的结构呈条状覆盖于枸杞表皮。但枸杞表皮蜡质并非为光滑的束状条带，而是枸杞外果皮细胞壁外侧呈现脊状突起的结构，蜡质成膜片状覆盖在其上面。目前关于枸杞果皮结构、果皮蜡质微形态和组分的研究仅限于成熟期枸杞果实，随着枸杞栽培品种的多样化，不同品种由于果实特性的差异，在制干方面存在的差异也日趋显现，而以往的一些传统制干剂已不能满足当前品种多样化的需求，因此，开展不同品种枸杞果实结构、果皮蜡质微形态、蜡质含量及组分的研究，以期揭示影响不同品种枸杞果实制干差异的原因，对于下一步筛选不同品种专用促干剂及其配套制干方法，缩短枸杞鲜果制干时间和提高制干率具有重要的理论指导意义。为此，本研究以当前宁夏枸杞种植中普遍栽培的‘宁杞1号’和‘宁杞5号’品种为材料，通过采集不同发育时期枸杞果实，进行果实结构发育、果皮蜡质微形态、单位面积蜡质含量及蜡质组分的研究，明确不同枸杞品种果皮蜡质组分差异，为不同枸杞品种适宜促干剂的筛选以及促干剂的合理使用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为栽培于宁夏芦花台园林场枸杞种植基地7年生宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)品种‘宁杞1号’和‘宁杞5号’，于2020年6月～7月中旬对宁夏枸杞夏果(七寸枝)进行取样观察和测定，实验采取定点定株的方法，各选取20株枸杞于6月10日用毛线标记同一天开放的花朵(花瓣紫堇色，花药坚挺白色未开裂)，分别取花后7 d(6月17日)、15 d(6月25 日)、24 d(7月4日)和33 d(7月13日)的枸杞果实，于FAA固定液中固定，置于采样箱带回实验室。

1.2 观测指标及方法

1.2.1 果皮结构显微镜观察以花后7 d、15 d、24 d和33 d的枸杞果实为材料，参照杨涛等[20]的石蜡切片法制片。切片用Leica-DMLB型显微镜观察并照相。

1.2.2 果皮蜡质形貌结构扫描电镜观察枸杞果实果皮蜡质形貌结构观察参照徐秀苹等[21]的方法。分别撕取脱蜡前和脱蜡后‘宁杞1号’和‘宁杞5号’青果期、色变期和成熟期枸杞果实表皮，采用叔丁醇+乙醇不同浓度置换后冷冻干燥；叔丁醇：酒精置换浓度分别为：90%乙醇+10%叔丁醇，80%乙醇+20%叔丁醇，65%乙醇+35%叔丁醇，50%乙醇+50%叔丁醇，25%乙醇+75%叔丁醇，100%叔丁醇，每次15～20 min，最后将样品浸泡在100%叔丁醇中-20 ℃过夜；之后放在冷冻干燥器(德国Martin Christ)内完成样品干燥。干燥后的样品黏贴到样品台上，干燥后用离子溅射仪喷金，置于钨灯丝扫描电镜下进行观察。

1.2.3 果皮蜡质含量测定取青果期、色变期和成熟期30 g枸杞鲜果实，且计算出30 g果实的个数，从中随机取20粒果实，重复3次，采用游标卡尺逐个测定果粒纵径、横径，按照椭球形表面积公式计算单果表面积[=4/3π×(2×纵径×横径+横径×横径)][22]。然后将30 g鲜枸杞与正己烷以1∶1(g∶mL)的比例混合，常温浸泡2 h，过滤，浸出液用旋转蒸发仪40 ℃浓缩[23]，并经氮气吹干后用电子天平称重，作为GC-MS检测样品备用。蜡质含量的计算公式为：蜡质量浓度(μg/cm2)=(m1-m0)/S，S为30 g枸杞果实的总表面积；m1为蒸馏瓶和蜡质的质量；m0为原蒸馏瓶的质量。

1.2.4 果皮蜡质组分的GC-MS测定将前期实验获得的果皮蜡质样品溶于1.5 mL正己烷中，进行GC-MS分析检测(图1)，每个时期样品重复测定3次。

GC-MS的条件：HPGC6890/MS5972色谱柱：石英毛细管柱ATSE-54(30 m×250 μm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃，进样量1 μL；进样方式为分流，分流比为40∶1；程序升温：初始温度50 ℃(5 min)→260 ℃(20 ℃/min)；载气为He，载气流量为1 mL/min；接口温度为250 ℃；离子源温度为200 ℃；离子源电离能为70eV。

图1 ‘宁杞1号’枸杞果实成熟期挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ion flow map of volatile components in mature fruit stage of L. barbarum ‘Ningqi No.1’

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2019和IBM SPSS Statistics 19.0统计分析软件进行数据分析及差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 宁夏枸杞果实发育过程中果皮显微结构的变化

枸杞果实果皮由外果皮、中果皮和内果皮组成。由图2可知，‘宁杞1号’和‘宁杞5号’枸杞果实的外果皮均由1层紧密排列的近似方形细胞组成，随着果实的发育，方形细胞逐渐变为沿横轴排列的长方形细胞，用以适应体积的增大；中果皮则由含有大液泡的薄壁细胞和小型维管束组成，在果实的发育过程中，可以明显看到薄壁细胞的分裂和体积的增大，且‘宁杞5号’中果皮果肉细胞增大的速度明显较‘宁杞1号’快，细胞排列疏松程度也较‘宁杞1号’高；内果皮由2层细胞构成，在果实形成初期就已明显分化出2层长方形细胞，但其体积的增加比例低于中果皮薄壁细胞。同一采样时期，‘宁杞5号’果皮厚度明显大于‘宁杞1号’的果皮厚度。

A-D分别为‘宁杞1号’花后7 d、15 d、24 d和33 d果皮；E-H分别为‘宁杞5号’花后7 d、15 d、24 d和33 d果皮；Ep.外果皮；Me.中果皮；End.内果皮图2 宁夏枸杞果实不同发育时期果皮石蜡切片A-D are peels of ‘Ningqi No. 1’ at 7, 15 24 and 33 days after anthesis respectively, and E-H are peels of ‘Ningqi No. 5’ at 7, 15, 24 and 33 days after anthesis, respectively; Ep. Exocarp; Me. Mesocarp; End. EndocarpFig.2 Fruit peel paraffin section of L. barbarum L. at different developmental stages

2.2 宁夏枸杞果皮蜡质晶体结构和果实表面积分析

根据李文佃等[24]的研究，枸杞果实发育成熟大约需要35 d，根据花和果实颜色等的变化情况可将其发育时期划分为形成期、青果期、色变期和成熟期。通过扫描电镜观察(图3，A、C、E、G、I、K)，‘宁杞1号’和‘宁杞5号’枸杞表皮细胞外侧细胞壁均呈现脊状突起的结构；在青果期脊状突起不连续，脊和脊之间排列紧密；随着发育时期的延后，脊状突起的连续性逐渐增强，且脊与脊之间的间距逐渐变宽，蜡质成膜状覆盖于突起的脊和两脊之间的沟内；随果实发育成熟，推测蜡质层总体呈现逐渐增厚的趋势。从发育时期整体来看，‘宁杞5号’果皮外表皮脊状突起的连续性较‘宁杞1号’明显，蜡质层的起层现象也较‘宁杞1号’明显，两脊之间的间隙较‘宁杞1号’略宽，蜡质排列分布的均匀性和规律性也较‘宁杞1号’强，但覆盖在脊状突起表皮的蜡质层较‘宁杞1号’薄。同时，经正己烷脱蜡后(图3，B、D、F、H、J、L)，3个生育时期枸杞果皮蜡质层都能较为明显地溶解于有机溶剂正己烷中，覆盖在枸杞表皮的蜡质层几乎能够完全去除，且‘宁杞5号’的去除效果优于‘宁杞1号’。未经去除的蜡质层经过溶剂的刺激积聚成大小不等的颗粒状，这样也更加便于水分能够从没有蜡质覆盖的部分散失出去。

另外，参照袁慧君等[22]的枸杞果实面积的测定方法，对宁夏枸杞不同发育时期的枸杞果实表面积进行了测定与计算(图4)，发现随着两品种枸杞果实逐渐发育成熟，果实的表面积不断增大，且不同品种不同发育时期的果实表面积间差异显著；同时，‘宁杞5号’枸杞果实表面积始终较同期‘宁杞1号’大。

2.3 宁夏枸杞果皮蜡质含量和组分分析

‘宁杞1号’和‘宁杞5号’枸杞果实果皮蜡质含量随着发育时期先下降后上升(图5)。其中，‘宁杞1号’青果期、色变期和成熟期的蜡质总量分别为75.52、30.88和92.27 μg/cm2，‘宁杞5号’3个时期的蜡质总量则分别为66.91、51.78和78.34 μg/cm2；‘宁杞1号’在生育期的波动更大，其果实果皮蜡质总量总体较‘宁杞5号’高。方差分析表明，‘宁杞1号’蜡质总量在青果期和成熟期均显著高于色变期，而青果期与成熟期无显著差异；‘宁杞5号’蜡质总量表现为成熟期显著高于色变期，其余2个时期的蜡质总量并无显著差异。

同时，通过GC-MS分析(表1)，‘宁杞1号’枸杞果实表皮蜡质混合物中在青果期、色变期和成熟期分别鉴定到117、84、86种物质，其中青果期、色变期和成熟期特有的物质分别有58、23和49种，同时鉴定到3个生育期共有的物质23种；‘宁杞5号’枸杞果实表皮蜡质混合物中在青果期、色变期和成熟期分别鉴定到126、80和81种物质，其中青果期、色变期和成熟期分别有特有物质64、17和17种，同时鉴定到3个生育期共有的物质43种。

参照曾琼等[25]对植物蜡质的分类，将枸杞果实表皮蜡质混合物分为酯类、醇类、烷烃类、酮类、碘代烷烃类、醛类和酸类，‘宁杞1号’在青果期和色变期果皮蜡质组分分别有7类物质，成熟期果皮蜡质组分有6类物质，无醛类，烷烃类为3个发育时期主要组分(图6)。‘宁杞1号’青果期和色变期的蜡质组分主要为烷烃类、醇类和碘代烷烃类，青果期峰面积百分比分别为45.6%、12.81%和7.93%，色变期则分别为47.18%、8.66%和5.77%；成熟期的蜡质组分主要为烷烃类、醇类和酯类，峰面积的百分比分别为48.42%、5.35%和6.68%。‘宁杞5号’在青果期果皮蜡质组分有6类物质，无醛类；在色变期果皮蜡质组分有5类物质，无酮类和醛类；在成熟期果皮蜡质组分有6类物质，无酮类。‘宁杞5号’青果期和色变期的蜡质组分主要为烷烃类、醇类和碘代烷烃类，青果期峰面积百分比分别为43.80%、14.40%、8.21%，色变期分别为56.40%、7.16%、6.27%；成熟期的蜡质组分主要为烷烃类、醇类和酯类，峰面积百分比分别为49.47%、3.73%和2.52%。

图6 宁夏枸杞不同发育时期果皮蜡质组分的峰面积百分比Fig.6 Peak area percentage of waxy components of L. barbarum pericarp at different developmental stages

2.4 宁夏枸杞果皮蜡质组分的主成分分析

2.4.1 ‘宁杞1号’主成分分析结果(表2和表3)显示，‘宁杞1号’在青果期可以提取到1个特征值大于1的主成分，特征值为11.448，方差贡献率为95.397%，累计贡献率为95.397%；青果期果皮蜡质的第一主成分为二十七烷、二十八烷、廿六烷、1-碘代-三十烷烃、二十二烷酸、二十四烷酸和[1R-(1α，3a.β，4α，8a.β，9S*)]-十氢-1，5，5，8-四甲基-1，4-甲基唑烯-9-醇。这些成分都属于蜡质组分中的烷烃类、酸类、碘代烃类和醇类。‘宁杞1号’在色变期可以提取到2个特征值大于1的主成分，特征值分别为6.441和4.559，方差贡献率分别为58.554%和41.446%，累计贡献率为100%。色变期果皮蜡质的第一主成分主要为1-碘代-二十八烷、十八烷基-3,5双(1,1-)-4-二甲基乙基羟基苯丙酸酯、2-己基-1-癸醇和二十二烷酸等；第二主成分主要为δ8(14)-异海松酸、11，13-二甲基-12-十四烯-1-醇醋酸酯、二十八烷、β-香树素和廿六烷等，这些成分都属于蜡质组分中的烷烃类、酯类、醇类、酸类和碘代烷烃类。‘宁杞1号’在成熟期可以提取到2个特征值大于1的主成分，特征值分别为7.143和5.857，方差贡献率分别为54.944%和45.056%，累计贡献率为100%。成熟期果皮蜡质的第一主成分主要为双(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸二丁酯、二十七烷、顺-9-十四烯酸异丁酯、11，13-二甲基-12-十四烯-1-醇醋酸酯、二十二烷酸和β-香树素；第二主成分主要为2-辛基-1-十二醇、二十四烷酸、1-(乙烯氧基)-十八烷、[1R-(1α，4a.β，5β，6α，8aβ)]-2(1H),5-[2-(3-呋喃基)乙基]八氢-1，5，6，8-四甲基-萘酮、法尼醇异构体a，这些都属于蜡质组分中的酯类、烷烃类、酸类、醇类和酮类。

表2 宁夏枸杞不同发育时期主组分的特征值及累计贡献率

表3 ‘宁杞1号’不同发育时期枸杞果实组分矩阵

表4 ‘宁杞5号’不同发育时期枸杞果实成分矩阵

2.4.2 ‘宁杞5号’主成分分析结果(表2、表4)显示，‘宁杞5号’在青果期可以提取到2个特征值大于1的主成分，特征值分别为10.09和4.91，方差贡献率分别为67.268%和32.732%，累计贡献率为100%；青果期果皮蜡质的第一主成分主要为廿六烷、十七烷基-环氧乙烷、二十八烷、β-香树素、1-碘代-三十烷、二十二烷酸和十八烷基-3,5双(1,1-)-4-二甲基乙基羟基苯丙酸酯；第二主成分主要为1-乙烯氧基-十八烷和二十二醇。这些成分为蜡质组分中的烷烃类、酸类、醇类、酯类和碘代烷烃类。‘宁杞5号’在色变期可以提取到2个特征值大于1的主成分，特征值分别为11.355和5.645，方差贡献率分别为6.794%和33.206%，累计贡献率为100%；色变期果皮蜡质的第一主成分主要为二十七烷、2-己基-1-癸醇、二十烷酸、十八烷基-3,5双(1,1-)-4-二甲基乙基羟基苯丙酸酯、十六烷基-环氧乙烷、16-氧基甲基-环氧乙烷、9-十八碳烯酸(Z)-苯甲酯和1-碘代-三十烷；第二主组分主要为二十二烷酸和廿六烷。这些成分属于蜡质成分中的烷烃类、酯类、酸类、碘代烷烃类和酸类。‘宁杞5号’在成熟期可以提取到2个特征值大于1的主成分，特征值分别为9.501和5.499，方差贡献率分别为63.342%和36.658%，累计贡献率为100%；成熟期的第一主成分主要为二十一烷、1-碘代-二十八烷、二十八烷、11，13-二甲基-12-十四烯-1-醇醋酸酯和二十七烷；第二主成分主要为二十碳烷和十五烷。这些成分为蜡质组分中的烷烃类、酯类和碘代烷烃类。

3 讨 论

植物表皮的蜡质晶体在不同植物间都有所差异，蜡质的晶体形态有片状、杆状、管状、棒状等类型。Barthlott等[26]发现晶体的形态在植物生长发育过程中会随着蜡质含量的变化而有所改变。也有研究表明，蜡质的组分对蜡质的结构有一定的影响，当烷烃含量占主导地位时，植物蜡质结构表现为无晶体或表面光滑；当蜡质组分多为β-二酮和羟基-β-二酮时，蜡质结构则为管状或棒状结构；而当脂肪醇含量较高时，蜡质结构则为片状结构[27-28]。本研究中，青果期蜡质结构均呈膜状结构覆盖在枸杞外侧呈脊状突起的外果皮上，随着发育时期的延后，色变期外果皮表面脊状突起的规律性和连续性更加明显，果皮蜡质依然均匀分布在呈脊状突起的外果皮上，成熟期则呈现出‘宁杞1号’果皮蜡质层比‘宁杞5号’的更加致密和均匀，导致这种现象的原因可能与果实发育后期‘宁杞5号’果实膨大速率大于‘宁杞1号’有关。这与王永旭[29]的研究结果一致，利用SEM扫描电镜观察不同发育时期苹果果皮蜡质形态，果皮蜡质随着发育时期的延后覆盖程度逐渐增加，发育末期完全覆盖果皮且表皮蜡质逐渐积累。也与Koch等[30]研究的研究结果相同，果皮蜡质为光滑的蜡膜层，是由以烷烃类物质为主的多种组分共同作用而成。因此，观察枸杞果实整个发育过程发现，蜡质积累不断增加，而果实发育后期表皮蜡质积累厚度降低，这可能是由于随着枸杞果实发育时期的延后，果实直径的增大引起表面积的突增造成的，同时也导致了蜡质层的厚度较前期有所下降，造成这些结果的原因都需要进一步研究。

植物表皮蜡质具有多种功能，如抵御外界侵害、果实贮藏保鲜、防止非气孔性水分散失和影响果实品质等[2, 31-32]。植物表皮蜡质含量的高低也对植物的功能有一定的影响。有研究发现突变体wsll植株的蜡质含量低于正常植株，且抗旱能力也弱于野生型植株，表明植株抗旱能力与蜡质含量呈正相关[33]。张海禄等[34]关于大麦叶片的研究也发现，大麦叶片的蜡质含量越高，水分利用效率越高，表明叶片表皮蜡质与水分利用率呈显著正相关。本研究发现，从青果期到成熟期，枸杞果皮蜡质总量先下降后上升，‘宁杞1号’枸杞果皮蜡质总量在青果期和成熟期显著高于色变期，‘宁杞5号’枸杞果皮蜡质含量在成熟期显著高于色变期。这与Leide等[35]和Kosma等[36]在番茄上的研究结果不一致，Li等[37]在苹果中的研究发现，随果实的逐渐成熟，苹果蜡质总量表现为上升的趋势，也与本研究结果不同，可能是植物间的遗传差异以及种植年份的不同所致。

角质膜的渗透性不一定与其厚度或者蜡质的覆盖程度有关，很大程度上可能与其化合物的组成或者结构相关。Leide等[38]在番茄突变体中发现，突变体角质层的水分透性增加与果实蜡质三萜类和甾醇类物质含量呈正相关，与正构烷烃、醛类和酯类含量呈负相关，表明果实蜡质组分对角质层水分透性有影响。王永旭[29]报道，苹果果皮蜡质主要含有长链烷烃、脂肪醇、脂肪醛、游离脂肪酸和三萜类等物质，但却在葡萄和草莓中难以检测到相同的蜡质组分[8, 39]，表明植物种类不同，植物蜡质组分也不尽相同。在生产中，‘宁杞1号’和‘宁杞5号’枸杞果实制干率后的商品率分别为71.73%和41.35%(课题组数据未发表)。本研究利用GC-MS技术测定了‘宁杞1号’和‘宁杞5号’枸杞不同发育时期果皮的蜡质组分，它们都含有酯类、醇类、烷烃类、酮类、碘代烷烃类、醛类和酸类，其蜡质组分没有差异，但蜡质组分所占的面积百分比和碳链的分布有差异；蜡质组分的占比可能影响枸杞果实表皮的水分透性，烷烃类、醇类、醛类和酯类具有保持果实水分的功能，且阻止水分渗透作用的功能较强。

进一步主成分分析的结果表明，在青果期、色变期和成熟期3个生育时期，‘宁杞5号’果实蜡质组分比‘宁杞1号’含有更多的烷烃类物质，而烷烃类物质可以增强果实的持水能力[40]，表明‘宁杞5号’较‘宁杞1号’果皮的保水性更强，说明在枸杞干制过程中‘宁杞1号’较‘宁杞5号’更易制干。这与Isaacson等[13]在番茄突中的研究一致，即野生型番茄果皮的蜡质中烷烃类蜡质组分高于突变体植株，说明蜡质组分中保水性最好的组分为烷烃类物质。

综上所述，影响不同品种枸杞果实制干的原因在于枸杞果皮蜡质含量、结构和蜡质组分。烷烃类成分能够有效阻止果实体内水分的散失，‘宁杞5号’果皮蜡质中烷烃类成分多于‘宁杞1号’，比‘宁杞1号’的保水性更强，因此生产上‘宁杞1号’较‘宁杞5号’枸杞果实更易制干。该研究结果初步揭示了枸杞果皮蜡质的积累规律和不同品种间蜡质组分差异，进一步为解析枸杞果皮蜡质的分子调控奠定了基础，同时也为采后果实的保鲜技术与制干技术改良提供了新的方向。