肺ECM水凝胶抑制TGF-β1/Smad3通路减轻大鼠放射性肺纤维化

吴鹏飞 但梦霞 邱立志 弋可 王洪州 薛培丽

放射性肺纤维化的发病机理中，TGF-β1/smads通路有重要作用，TGF-β1升高不仅能促进巨噬细胞等向肺部游走、释放炎性因子，还能激活成纤维细胞，促使细胞外基质异常重塑，致纤维化[1-3]。而抑制smad3蛋白表达，肺组织损伤程度显著减轻[4]。吡非尼酮等抗纤维化药物价格贵、副作用多，因此需要寻找新的治疗手段。

细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)作为细胞骨架，还具有调节免疫、改善纤维化等功效[5-7]。Ghuman等将ECM制成液体，注入大脑局部，发现其可以长期附着并发挥良好修复作用[8]。因此，细胞外基质具有很高的临床应用价值，研究显示：气管内注射水凝胶，可降低放射性肺损伤大鼠血清TGF-β1水平[9]。因此，我们推测：肺ECM水凝胶可能是通过抑制TGF-β1/Smad3通路发挥抗纤维化作用。

资料与方法

一、制备肺ECM水凝胶

麻醉大鼠(4%戊巴比妥)，全身肝素化，肺动脉插管，分离肺组织[10]。将收获的肺ECM制成冻干粉并灭菌，-80℃保存。消化肺ECM冻干粉，磁力搅拌48 h，滴定pH至7.4，10×PBS稀释至1×PBS。

二、放射性肺纤维化模型制备

取大鼠，麻醉，仰卧固定。胸部之外用铅板遮挡， 20 Gy照射1次。

三、分组及处理

27只大鼠，随机分为3组(n=9)：Control组、IR+NS组、IR+ECM组：Control组为阴性对照组， IR+NS组在造模后0.5 h气管内注射0.9%氯化钠500 μl，IR+ECM组以同样方式注射等量肺ECM水凝胶，观察点：造模后第16周。

四、肺系数

处死大鼠时，称体重，处死后取肺，滤纸吸干后称重，为湿重，肺湿重(mg)/体重(g)×100记为肺系数。

五、病理学检测

取部分左肺组织，4%多聚甲醛固定72 h， H&E及 Masson 染色，观察病理改变，行肺泡炎及纤维化评分。

六、western blot检测

-80℃冰箱取肺组织100 mg，加1 mL裂解液，制组织匀浆，高速离心30 min(10000 r/min)，取上清，BCA法蛋白定量。制备电泳凝胶，每孔蛋白上样量约40 μg，电泳分离样本，湿法转膜，5%BSA封闭1h；孵一抗(4℃过夜)，洗膜；孵二抗(2h)，洗膜，ECL法显色，软件计算蛋白相对表达量。

七、肺组织中Hyp含量测定

-80℃冰箱取肺组织80 mg，按说明书碱水法测定。

八、Elisa法测血清TNF-α、TGF-β1、IL-6：取血3 mL，4℃离心15 min(5000 r/min)，取上清1 mL，按试剂盒说明书操作，酶标仪检测450 nm处的吸光度值。

九、统计方法

结 果

一、肺ECM水凝胶能均匀地附着在大鼠肺泡表面

新鲜肺组织颜色红白相间，制成肺ECM 后，肉眼见肺脏变透明，HE染色未见细胞核成分(见图1)。酶消化后制成水凝胶，注射入大鼠肺组织，免疫荧光显示其能均匀分布于大鼠肺泡内(见图2)。

图1 a：肺组织脱细胞前；b：肺组织脱细胞后；c：脱细胞肺组织HE染色(×200)

图2 肺ECM水凝胶在大鼠肺组织的分布(×200)

二、肺ECM水凝胶能减轻肺组织水肿及炎症反应

在造模后第16周，各组间差异有统计学意义(F=32.574，P<0.001)；与control组比较，IR+NS组及IR+ECM组大鼠肺系数均增高，与IR+NS组比较，IR+ECM组大鼠肺系数减小(P<0.05)(见表1)。

表1 3组大鼠肺系数的比较

在照射后第16周，HE染色显示：Control组大鼠，肺泡结构正常， IR+NS组大鼠肺泡间隔明显变厚，部分肺泡结构破坏，局部区域均匀红染。IR+ECM组大鼠上述病理改变减轻。三组大鼠肺泡炎评分比较，经方差分析，差异有统计学意义(F=17.432，P<0.001)，与IR+NS组比较，IR+ECM组大鼠肺泡炎评分减小(P=0.040)(见图3A、3C)。Masson染色显示： Control组大鼠肺组织中无明显胶原纤维沉积， IR+NS组大鼠肺组织中可见弥漫性胶原纤维聚集，IR+ECM组大鼠肺组织中蓝染区域明显减少，纤维化评分较IR+NS组下降，经方差分析，差异有统计学意义(F=41.061，P<0.001)(见图3B、3D)。

图3 病理染色及评分：A：HE染色(×200)；B：Masson染色(×100)；C：肺泡炎评分；D：胶原评分；与control组比，*P<0.05；与IR+NS组比， #P<0.05

三、肺ECM水凝胶能减轻大鼠全身炎症反应

建模后第16周，各组间血清TNF-α、IL-6及TGF-β1水平差异有统计学意义(FTNF-α=21.092、PTNF-α<0.001；FIL-6=36.711、PIL-6<0.001；FTGF-β1=41.431、PTGF-β1<0.001)，与Control组比较，IR+NS组与IR+ECM组大鼠血清TNF-α、IL-6、TGF-β1均升高，与IR+NS组比较，IR+ECM组血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平下降，(P<0.05)(见表2)。

表2 血清IL-6、TNF-α、TGF-β1表达

四、肺ECM水凝胶抑制放射诱导的TGF-β1、smad3、p-smad3、α-SMA蛋白表达

在照射后第16周，各组间肺组织中TGF-β1、smad3、p-smad3、α-SMA蛋白水平差异有统计学意义(FTGF-β1=19.037、PTGF-β1<0.001；Fsmad3=32.029、Psmad3<0.001；Fp-smad3=33.038、Pp-smad3<0.001；Fα-SMA=33.848、Pα-SMA<0.001)，与Control组相比，IR+NS组与IR+ECM组大鼠肺组织中TGF-β1、smad3、p-smad3、α-SMA蛋白表达增加，与IR+NS组比较，IR+ECM组上述蛋白表达均有下降，(P<0.05)(见图4)。

图4 三组大鼠肺组织中TGF-β1/Smad3信号通路表达水平：*P<0.05 versus control group; **P<0.05 versus IR+NS group

五、肺ECM水凝胶能减轻放射诱导的Hyp表达

照射后第16周，各组间肺组织Hyp含量差异有统计学意义(F=49.971，P<0.001)，与Control组比较，IR+NS组与IR+ECM组大鼠肺组织中Hyp含量增加，与IR+NS组比较，IR+ECM组大鼠肺组织中Hyp含量下降，(P<0.05)(见图5)。

图5 Hyp的含量：与control组比，*P<0.05；与IR+NS组比， #P<0.05

讨 论

放射性肺纤维化演变过程复杂，TGF-β1在其中占据着“阀门”地位，它能诱导PDGF、TNF-α、IL-6、IL-13等多种细胞因子合成及释放，还能通过增加smad3磷酸化，促进下游促纤维化基因表达[11]。ECM支架材料具有良好组织相容性及多种生物学功效。真皮来源的水凝胶已用于创伤愈合、改善局部纤维化等[12-13]。本研究结果显示：气管内注射肺ECM水凝胶后，放射性肺纤维化大鼠肺组织病理学改善，纤维化程度减轻，证实了肺ECM水凝胶具有抗放射性肺纤维化的功效。

TNF-α能调节成纤维细胞的增殖活化及细胞外基质成分，抑制TNF-α表达可减轻博来霉素诱导的肺纤维化[14-15]。IL-6是常见炎性因子，研究显示：肺纤维化大鼠血清中IL-6水平显著升高，降低IL-6水平可以改善IPF症状[16]。TGF-β1异常升高可以促进TNF-α、IL-6的释放，Chen等在研究EP对RILI作用中观察到：照射后第4周、第20周，小鼠血清中TGF-β1水平均显著高于对照组，抑制TGF-β1表达后，早期炎症反应及后期纤维化均有缓解[17]。TGF-β1主要通过促进smad3磷酸化,发挥促纤维化作用[18]。研究报道：辐射后的肺组织中smad3、smad2 mRNA及蛋白表达升高，smad7基因表达下降，甘草次酸干预后，smad3、smad2基因表达受抑制、smad7基因表达增强，肺纤维化改善[19]。而smad3基因敲除的小鼠对前列腺素诱导的心室重构、辐射诱导的肺纤维化抵抗性增强[20-21]。α-SMA是成纤维细胞活化的标志性蛋白，其过度表达，使得组织过度收缩、最终纤维化，其表达受smad3调控，余洪刚用TGF-β1干预成纤维细胞后观察到：细胞中α-SMA的mRNA及蛋白表达均显著增加，进一步在小鼠肺纤维化模型中发现：模型小鼠肺组织中Smad3、Snail、α-SMA蛋白表达上升，胶原沉积增多，通过复明汤灌胃后，上述蛋白表达得到抑制，肺纤维化程度得到改善[22]。本研究显示：在照射后第16周，血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平明显升高，肺组织中smad3、p-smad3蛋白表达增加，伴随着肺组织纤维化形成，而经肺ECM水凝胶干预后，血清中炎性因子水平下降，肺组织中smad3、p-smad3表达水平下降，Masson染色显示纤维化程度减轻。羟脯氨酸在胶原蛋白中特异性表达，因此可以通过检测肺组织中羟脯氨酸含量评估纤维化程度。本实验结果显示：气管内注射肺ECM水凝胶，可以显著抑制放射性肺损伤大鼠肺组织中α-SMA蛋白表达以及羟脯氨酸生成，从而发挥抗纤维化作用。

综上所述，本实验结果显示：肺ECM水凝胶能改善大鼠放射性肺纤维化，这可能是通过抑制TGF-β1/Smad3信号激活实现的。