绿肥和施氮对旱作冬小麦农田土壤酶活性的影响

冯晓玲，王 俊，2，高 媛，温萌萌，豆 莹，方震文

(1.西北大学城市与环境学院，陕西 西安 710127; 2.陕西省地表系统与环境承载力重点实验室，陕西 西安 710127)

“藏粮于地、藏粮于技”是我国当下农业生产的重大战略需求，如何寻求一种可持续的管理方式，在保障粮食安全的同时全面提升土壤质量是一个亟待解决的学术命题。在主要粮食作物生长休闲期间，引种豆科或非豆科绿肥填闲作物具有促进土壤碳氮固存[1]、改善土壤结构、促进微生物代谢、减少养分淋溶和抑制杂草病虫害[2]等多种生态环境效益，此种植技术近年来在世界范围内得到大面积推广应用。

土壤中各种生物化学反应过程都有酶的参与[3]。土壤酶对于外部变化引起的反应是快速且敏感的，酶活性的大小可以反映其控制的酶促反应的方向和强度[4]。一方面，研究酶活性可以比较不同农田管理措施下土壤环境特征变化，另一方面，它可以反映土壤碳、氮元素的转化，进而评价土壤养分的转化。孙颖[5]、彭映平[6]等研究发现，在黄土高原地区种植豆科绿肥能显著提高土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶、芳基硫酸酯酶和脱氢酶活性，其原因主要在于绿肥翻压后增强了土壤有机质、氮素等养分含量，提高了土壤微生物的活性，改善了土壤性状所致。与豆科绿肥相比，非豆科绿肥通常具有更大的生物量积累，因而翻压入土后能够增加底物供给，促进土壤碳、氮固定[7-8]。然而就目前研究来看，针对豆科绿肥、非豆科绿肥及豆科和非豆科混播绿肥对土壤酶活性的报道尚不多见。

本文基于田间定位试验, 比较了种植豆科和非豆科绿肥对土壤酶活性的影响差异，并重点关注与土壤碳、氮循环相关的β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶活性变化，旨在进一步探讨绿肥种植系统土壤肥力提升机制，并为其在黄土高原旱作农业区的推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

田间试验在陕西省长武县黄土高原农田生态系统国家野外科学观测研究站(107°44′E，35°12′N) 进行。该站地处黄土高原中南部，海拔1 220 m，属暖温带半干旱半湿润大陆性季风气候，年均气温9.1℃，无霜期约171 d，年均蒸发量1 440 mm，年均降水量为580 mm，且季节性分布不均，多集中于夏秋季节。试验地土壤为黑垆土，供试土壤基本理化性质如下：有机质12.0 g·kg-1，全氮0.8 g·kg-1，全磷0.66 g·kg-1，矿质氮13.74 g·kg-1，速效磷24.6 mg·kg-1、速效钾161.39 g·kg-1，pH 8.11。该研究区属于典型旱作农业区，种植制度为一年一熟或两年三熟。

1.2 试验设计

试验自2017年7月初前季小麦收获后开始，采取绿肥作物和施氮水平双因素完全随机区组设计，其中绿肥作物在前季冬小麦收获后的夏季休闲期种植，包括长武怀豆单播(SB)、苏丹草单播(SG)、长武怀豆+苏丹草混播(MIX)和裸地休闲(CK)，氮肥在冬小麦播前施入，包括0、60、120 kg·hm-2共3个水平。总计12个处理，每处理重复3次，共36个小区，随机区组排列。小区面积6.7 m×10 m，小区间留有保护行，宽度1 m。

绿肥作物每年6月底至7月初冬小麦收获后播种，其中SB处理长武怀豆播量为70 kg·hm-2，SG处理苏丹草播量为35 kg·hm-2, MIX处理中怀豆和苏丹草播量分别为35 kg·hm-2和17.5 kg·hm-2。绿肥作物于每年9月中旬使用旋耕机将地上部分全部直接翻压入土，翻压深度为20 cm，两周后播种冬小麦，播量为165 kg·hm-2。小麦播种时按氮肥水平设计分别施入尿素(46%)，同时各小区按60 kg·hm-2施入过磷酸钙作为基肥。

2021年6月在小麦收获后按五点采样法采集表层(0～10 cm和10～20 cm)土样，充分混合，去除植物残根等杂物，过2 mm筛后装入自封袋中，放置在装有冰袋的保温箱带回实验室。

1.3 指标测定

采用96孔微孔板荧光法[9]测定了4种水解酶活性，分别为β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase)、纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase)、乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-1,4-N-acetylglucosaminidase)和亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase)。测定时所用的底物分别是是4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-纤维素二糖苷、4-甲基伞形花序基N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷、L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐。另外，β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶所用的标准物质均为4-甲基伞形酮，亮氨酸氨基肽酶所用的标准物质为7-氨基-4-甲基香豆素。

具体测定步骤如下：称取1 g鲜土放入250 mL的塑料瓶，添加125 mL去离子水并摇晃60 s，制成悬浊液, 取200 μL悬浊液加入到96孔微孔板中, 每个样品有3个重复(200 μL样品悬浊液+ 50 μL酶底物), 3个阴性对照(200 μL去离子水+ 50 μL酶底物)和3个空白(200 μL样品悬浊液+ 50 μL去离子水)作为对照, 再加以3个淬火标准(200 μL样品悬浊液+ 50 μL标准液)及参考标准(200 μL去离子水+ 50 μL标准液)进行校正。微孔板在25℃黑暗条件下培养4 h，加入10 μL 0.5 mol·L-1的NaOH溶液使其停止反应。用Synergy H4多功能酶标仪(Molecular Devices, SanJose, USA)测定荧光值, 荧光激发光和检测光波长分别在365 nm和450 nm处。

土壤酶活性计算公式为[9]:

Ab=F×V/(eV1t×m)

(1)

F=(f-fb)/q-fs

(2)

e=fr/(csV2)

(3)

q=(fq-fb)/fr

(4)

式中，Ab表示土壤样品的水解酶活性，F表示样品的荧光值，V表示土壤悬浊液的体积(125 ml)，V1表示微孔中的土壤悬浊液的体积(200 μl)，t表示暗培养的时间(4 h)，m表示风干土壤的质量。f表示样品微孔的荧光值，fb表示空白微孔的荧光值，fs表示阴性对照的荧光值，fr表示参考标准微孔的荧光值，fq表示淬火标准的荧光值。e表示荧光释放系数，q表示淬火系数，cs表示参考标准微孔中的浓度(10 μmol·L-1)，V2表示加入的标准物质的体积(50 μl)。酶活性以每小时每克干物质消耗底物的摩尔数(nmol·g-1·h-1)来表示[14]。

总体酶活性指数(Total enzyme activity index， TEI)计算公式[10]为：

(5)

1.4 数据分析

数据使用SPSS 25.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 绿肥和施氮对β-葡萄糖苷酶活性的影响

绿肥种植和施氮对土壤β-葡萄糖苷酶活性均具有极显著的影响，但二者没有交互作用(表1)。与CK相比，SB、SG、MIX处理β-葡萄糖苷酶活性在0～10 cm土层分别提高了59.2%、41.2%和29.4% (P<0.05)，在10～20 cm土层分别提高了36.5%、41.8%和21.4%(P<0.05)，不同绿肥处理间差异不显著(图1A)。随着施氮量增加，土壤β-葡萄糖苷酶活性呈增加趋势(图1B)，其中施氮水平120 kg·hm-2显著高于不施氮和施氮60 kg·hm-2，相较于不施氮肥，施氮60 kg·hm-2和120 kg·hm-2处理在0～10 cm土层分别提高土壤β-葡萄糖苷酶活性17.1%和46.6%，在10～20 cm土层分别增加了17.8%和69.4%。

图1 绿肥(A)和施氮(B)对β-葡萄糖苷酶活性的影响

2.2 绿肥和施氮对纤维二糖水解酶活性的影响

由表1可以看出，绿肥和施氮对纤维二糖水解酶活性均具有极显著影响，且二者在0～10 cm土层存在显著交互作用。与CK相比，SB、SG、MIX处理土壤纤维二糖水解酶活性在0～10 cm土层分别增加了30.0%、25.9%和24.2%(P<0.05)，在10～20 cm土层分别增加了13.2%、15.6%和6.19%(P<0.05)，且绿肥作物间差异不显著(图2A)。土壤纤维二糖水解酶活性同样随着施氮量的增加而增加(图2B)。在不施氮情况下，0～10 cm土层纤维二糖水解酶活性绿肥处理间差异不显著；而施氮后， SB处理土壤纤维二糖水解酶活性显著高于SG和MIX处理(图3)。

图3 0～10 cm土层绿肥与施氮交互作用对土壤纤维二糖水解酶活性的影响

2.3 绿肥和施氮对乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的影响

绿肥和施氮均对土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活性有显著影响，但二者交互作用不显著(表1)。与CK相比，SB、SG、MIX处理土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活性在0～10 cm土层平均分别增加了40.5%、28.5%和27.2%(P<0.05)，在10～20 cm土层分别增加了48.2%、32.9%和42.5%，且SB处理与SG和MIX处理之间差异显著(图4A)。随着施氮量增加，土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活性呈增加趋势(图4B)，其中施氮水平120 kg·hm-2的值显著高于不施氮和施氮60 kg·hm-2的值。

图4 绿肥(A)和施氮(B)对乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的影响

2.4 绿肥和施氮对亮氨酸氨基肽酶活性的影响

绿肥和施氮均对土壤亮氨酸氨基肽酶活性存在显著影响，但两者并无交互作用(表1)。由图5A可见，在不同的绿肥种植下表现为SB>SG>MIX>CK, SB、SG和MIX处理土壤亮氨酸氨基肽酶活性在0～10 cm土层相比于CK分别平均提高了35.8%、24.7%和12.9 %(P<0.05)，在10～20 cm土层分别增加了30.6%、18.5%和22%(P<0.05)，且SB与SG处理和MIX处理间差异显著(图5A)。土壤亮氨酸氨基肽酶活性同样随着施氮量的增加而增加(图5B)。相较于不施氮肥，施氮60 kg·hm-2和120 kg·hm-2处理在0～10 cm土层分别提高土壤亮氨酸氨基肽酶活性47.4%和108%，在10～20 cm土层分别增加了45.4%和93.6%。

图5 绿肥(A)和施氮(B)对乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的影响

2.5 绿肥和施氮对总体酶活性的影响

绿肥和施氮均对总体酶活性有显著影响，但两者并无交互作用(表1)。由图6A可见，在不同的绿肥种植下，总体酶活性表现为SB>SG>MIX>CK, 相比于CK，SB、SG和MIX处理土壤总体酶活性在0～10 cm土层平均分别提高了35.9%、21.4%和20.9%(P<0.05)，在10～20 cm土层中分别增加了23.5%、15.8%和13.2%(P<0.05)。与不施氮相比，施氮60 kg·hm-2和120 kg·hm-2均导致土壤总体酶活性显著增加，且二者差异显著(图6B)。

图6 绿肥(A)和施氮(B)对总体酶活性的影响

3 讨 论

土壤酶活性可反映土壤养分转化的动态过程[11]。土壤β-葡萄糖苷酶和纤维二糖水解酶均参与土壤有机质矿化分解过程[12]，其中纤维二糖水解酶参与将纤维素水解为纤维二糖的过程[13]，而β-葡萄糖苷酶则将较为简单的多糖水解为葡萄糖单糖[14]。本研究中种植绿肥后这两种土壤酶活性均有显著提高，与前人研究结果一致[15]。绿肥翻压增加了土壤有机质输入，提高了微生物代谢底物供给水平，进而提高了土壤酶活性[16]。本研究中，怀豆当年地上生物量积累(3 754 kg·hm-2)显著低于苏丹草(5 040 kg·hm-2)和混播(4 953 kg·hm-2)，但绿肥种类对β-葡萄糖苷酶和纤维二糖水解酶活性的影响并无显著差异，这可能是因为绿肥翻压增加的底物输入已经满足了微生物代谢所需碳源，当底物供给水平到达一定程度时，酶活性并不会再提高[17]。

乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶与土壤氮素循环有关[18]，其中乙酰氨基葡萄糖苷酶主要催化几丁质水解的末端反应，在甲壳质和其他葡萄糖胺聚合物的降解中起着关键作用，而亮氨酸氨基肽酶主要作用于位于多肽末端的亮氨酸和其他疏水氨基酸的水解[18]。与上述两种碳循环相关的酶活性不同，怀豆处理土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶活性显著高于苏丹草和混播处理。尽管怀豆具有更低的生物量积累，但能通过生物固氮作用增加氮水平，同时其较低的碳氮比，导致残余分解后会有更多的氮释放，从而促进了这两种氮循环相关的酶活性[19]。

本研究中，土壤β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶均随施氮量的增加而增加，这证明氮素对酶活性的促进作用，这与之前的研究结果一致[20]，这可能是随着施氮量的增加，作物根系分泌物增加和土壤微生物数量增加，微生物通过同化利用这些施入的氮素来促进自身的生长，提高土壤微生物生物量水平，激发土壤有关微生物分泌酶，进而导致酶活性显著增加[21],但当施氮量超过一定阈值，过高的氮肥用量会导致酶活性的减弱[22-24]。在陕西长武田间试验中，彭映平等[6]研究发现，当施氮量为135 kg·hm-2时对土壤酶活性的影响最大，而当施氮量达到162 kg·hm-2时，土壤酶活性受到抑制。本研究中，氮肥施用量在 0～120 kg·hm-2范围内均有宜于提高土壤水解酶活性。

绿肥和施氮对纤维二糖水解酶活性的影响具有显著交互作用，但对其它三种酶活性并无交互影响。孙颖等[5]在陕西长武的试验发现，绿肥与氮肥对蔗糖酶、磷酸酶、芳基硫酸酯酶和脱氢酶活性具有显著的交互影响，但对脲酶活性无显著作用。而杨滨娟等[25]研究发现，施氮和绿肥的交互作用对过氧化氢酶和脲酶活性并不显著，更多地影响了转化酶活性。综上所述，绿肥和氮肥对土壤酶活性具有不同的影响机制，而添加氮肥会刺激绿肥残余的分解过程，其内在机理尚待进一步探索。

4 结 论

在黄土高原旱作农业区，冬小麦生长夏闲期种植长武怀豆、苏丹草或二者混播均能通过增加额外的有机输入刺激土壤酶活性的提高。绿肥种类差异并未显著影响土壤碳循环相关的β-葡萄糖苷酶和纤维二糖水解酶活性，但与非豆科绿肥或混播相比，种植豆科绿肥能通过改善土壤供氮水平而提高氮循环相关的乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶活性约12.9%～48.2%。增施氮肥能显著提高土壤酶活性，且随施氮量的增加土壤酶活性也显著提高，与不施氮肥相比，施氮60 kg·hm-2和120 kg·hm-2处理不仅可以提高土壤碳循环相关酶活性约17.1%～69.6%，还可以提高氮相关酶活性约19.1%～108%。综合来看，针对旱地冬小麦单作系统，夏闲期种植绿肥作物尤其是豆科绿肥作物结合后期增施氮肥能够增强土壤酶活性，进而提高土壤质量。