酶法辅助胶体磨同时提取糯米淀粉和蛋白质的工艺研究

何述栋 ，王雍飞 ，潘姝晓 ，李兴江 ，王家良 ，缪新亚 ，王振山 ，孙汉巨

（1.合肥工业大学 食品与生物工程学院，合肥 230061；2.蚌埠学院 食品与生物工程学院，安徽蚌埠 233030；3.安徽湘园食品科技有限公司，安徽蚌埠 233400；4.汇福粮油泰州有限公司，江苏泰州 225327）

0 引言

安徽省怀远县地处淮河流域腹地，气候适宜糯稻种植，是我国最大的糯米生产基地和交易集散地［1］。糯米是糯稻脱壳后的产品，北方俗称江米［2］，按照形状、黏度和种植区域分为梗糯和籼糯。糯米营养价值丰富，含有丰富的淀粉和蛋白质，大量的钙、磷、铁等金属元素以及维生素B1、维生素B2和烟酸等微量元素［3］。糯米具有补中益气、健脾养胃和润肌养颜的功效。因此，糯米深受我国消费者喜爱，是我国诸多传统食物，如年糕、八宝粥、粽子、汤圆等的重要原材料，也是酿制黄酒的主要来源［4］。随着现代营养健康食品的发展，以糯米淀粉和蛋白质为原料开发保健功能性食品成为新的市场关注点，前景巨大。然而，由于农村当地缺乏糯米精深加工能力，无法满足农业增收、农民增收的新需求。我国相关粮食作物研究多以大米为主，关于糯米的研究和开发报道较少。传统糯米深加工以水磨法制备糯稻淀粉为主，存在着得率低、能耗高的实际问题［5］，废水中含有大量的水溶性蛋白，造成了浪费和环境污染，蛋白质和淀粉分子均被植物细胞所束缚。因此，本文尝试采用酶法辅助破坏糯米结构，有效增加蛋白质和淀粉分子的溶出率，结合胶体磨和离心处理，通过物理特性差异同时制备糯米淀粉和蛋白质。试验结果可为糯稻综合加工的全面开展奠定基础，降低废水污染，提升产品附加值，具有较好的实际生产指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米原料：安徽湘园食品科技有限公司提供，产自安徽省怀远县，收获年份为2019年。纤维素酶（来源于黑曲霉，10 000 u/g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；果胶酶（来源于黑曲霉，10 000 u/g，北京百灵威科技有限公司）。所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1800型紫外可见光分光光度计（上海元析仪器有限公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（国华（常州）仪器制造有限公司）；FW100型小型高速万能粉碎机（上海楚定分析仪器有限公司）；JMFB-80型胶体磨（上海科劳机械设备有限公司）；TGL18M型台式高速冷冻离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；K1160型凯氏定氮装置（济南海能仪器股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 酶法辅助胶体磨同时提取糯米蛋白质和淀粉的工艺

取一定量的糯米样品用蒸馏水洗涤2次，粗粉碎后，加入与糯米质量比1：10的蒸馏水，调节pH值，加入酶制剂，在一定温度下酶解一段时间后，采用胶体磨碾磨成糯米浆，在4 ℃经6 500 rad/min离心作用后，获得富含蛋白质的上清液和富含淀粉的滤饼。上清液经乙醇逆流交换后，蛋白质析出，42 ℃干燥，得糯米蛋白粉；糯米粉饼经50 ℃干燥后，得糯米淀粉（水分含量小于12.5%）。

1.3.2 蛋白质含量的测定

原料以及烘干蛋白粉的粗蛋白质含量采用凯氏定氮法（GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》第一法）进行测定。

水提上清液中蛋白质含量采用考马斯亮蓝法进行测定，以系列浓度（mg/mL）牛血清白蛋白经考马斯亮蓝G-250染色后在595 nm处的相应吸光度值做标准曲线［6］。

式中 m1——水提上清液中蛋白质含量；

m2——原料中蛋白质含量。

1.3.3 糯米淀粉含量的测定

依据GB 5009.9—2016《食品安全国家标准食品中淀粉的测定》，采用酸水解法（第二法）对原料中糯米粗淀粉含量进行测定。

式中 m3—— 胶体磨离心沉淀的糯米粉饼淀粉质量；

m4——原料中淀粉质量。

1.3.4 糯米水分含量的测定

糯米粗水分含量的测定采用GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法（第一法）。

1.4 酶法辅助单因素优化试验设计

1.4.1 酶种类的选择

按工艺处理物料，分别加入物料重0.8%的纤维素酶、果胶酶、纤维素酶和果胶酶的复配（活性比1：1），进行后续处理，确定酶种类。

1.4.2 酶添加量的确定

按工艺处理物料，分别加入物料重0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%确定酶的量，进行后续处理，确定最佳酶添加量。

1.4.3 酶解时间的确定

按工艺处理物料，添加已确定的酶和量，分别酶解 30，45，60，75，90 min，进行后续处理，确定最优酶解时间。

1.4.4 酶解pH值的确定

按工艺处理物料，调节pH值至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，添加已确定的酶和量，按最优酶解时间进行后续处理，确定最佳pH值。

1.4.5 酶解温度的确定

按工艺处理物料，调节到最佳pH值，添加已确定的酶和量，分别在40，50，60 ℃按最优时间进行酶解，再进行后续处理，确定酶解温度。

1.5 数据处理

试验最少进行3次重复，结果以平均值±SD值表示；采用SPSS软件进行方差分析，P<0.05为差异显著；采用Origin软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 糯米原料的基本成分

经测定，试验用糯米原料的基本成分组成：粗水分含量为（11.5±1.2）%，粗蛋白质含量为（6.72±0.30）%，粗淀粉含量为（73.5±2.5）%。

糯米的主要组分是淀粉。糯稻是稻的黏性变种，其支链淀粉含量可达95%以上，因此加热可形成独特的黏性口感。依据糯稻的种植地域，不同品系的糯米其基本成分组成略有不同［7］。

2.2 酶种类的选择

传统的糯米蛋白质或淀粉的提取研究多以酶法为主［8］，常采用蛋白酶或淀粉酶，以水解某一主要成分为主要技术手段，而富集另外一个主要组分，不能同时制备2个完整的大分子。基于细胞破壁考虑，试验拟采用纤维素酶、果胶酶以及纤维素酶和果胶酶的复配（活力比1：1）分别处理糯米细胞壁，使水溶性蛋白和包裹其中的淀粉尽量释放出来，试验结果如图1所示。

图1 酶种类对同时提取糯米淀粉和蛋白质的影响Fig.1 Effect of enzyme types on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

单酶酶解效果好于复合酶的处理，且果胶酶协同胶体磨制备了较高提取率的糯米蛋白质和淀粉（P<0.05），这与郑典元等［9］对褐藻的酶处理结果相似。植物细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素和果胶，而糯米细胞间质的主要成分是果胶。因此，果胶酶在破开植物细胞壁的胞间层，解离细胞组织方面，会优于纤维素酶，紧接着在胶体磨作用力下，可以释放出较多的水溶性蛋白和淀粉分子［10］。纤维素酶可以水解细胞中 β -1，4 糖苷键链接的非淀粉多糖，导致胶体磨沉淀物的相对降低以及上清液组分的一定增多。在表观试验结果上，双酶复合处理呈现出蛋白质提取率与纤维素酶单酶处理差异不显著（P >0.05），但淀粉得率显著降低（P<0.05）的现象。根据江娅梅［11］采用纤维素酶和果胶酶对南瓜浆处理的研究报道可知，果胶酶在50 ℃时的酶解活力要好于纤维素酶，这也可能是本试验现象的一个原因。因此，在后续试验优选果胶酶进行处理。

2.3 酶添加量的确定

采用果胶酶处理浸泡糯米，酶添加量对胶体磨同时提取糯米淀粉和蛋白质的影响如图2所示。当果胶酶添加量比重为0.6%时，果胶酶对胶体磨同时提取糯米淀粉和蛋白质的影响显著提升。当添加量为0.8%时，同时获得最高的蛋白质提取率40.50%和最高的淀粉得率90.90%。随着酶添加量的继续提高，得率并未有显著提升，反而略有下降。随着酶添加量的增加，果胶酶水解胶质的反应速率加快，利于糯米颗粒破壁，使蛋白质和淀粉从细胞内和细胞间溶出，但是过量的果胶酶无法获得更多的酶作用位点，提取率不会继续显著提升。因此，试验优选果胶酶添加比重为0.8%继续进行单因素优化研究。

图2 酶添加量对同时提取糯米淀粉和蛋白质的影响Fig.2 Effect of enzyme addition on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

2.4 酶解时间的确定

酶解时间对胶体磨同时提取糯米淀粉和蛋白质的影响如图3所示。随着酶解时间的延长，糯米蛋白质提取率和淀粉得率均呈现缓慢增加的变化趋势。当酶解时间达到60 min时，糯米蛋白质和淀粉得率后续变化差异不显著（P>0.05），差异幅度较小，表明果胶酶在60 min时已基本与糯米颗粒结合完全，酶解较充分，继续增加酶解时间无法继续提高酶反应效率。因此，从经济成本考虑，试验确定60 min为最佳酶解时间。

图3 酶解时间对同时提取糯米淀粉和蛋白质的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

2.5 酶解pH值的确定

依据Osborne分级法，糯米等稻谷蛋白一般由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白组成［12］。其中，清蛋白溶于水，球蛋白易溶于盐溶液，2者约占蛋白总含量的4%～15%；谷蛋白约占蛋白总量的80%，多溶于稀酸、稀碱溶液；其余蛋白为醇溶蛋白，约占蛋白总量的1%～5%。前期研究表明，pH值对稻米蛋白的溶解性影响显著，在pH值4.0～7.0的环境中，稻米谷蛋白的溶解性缓慢增长，当pH值为9.0时，谷蛋白的溶解性显著提高。因此，为提高稻米蛋白质提取率，前期研究多采用NaOH等碱法提取，该条件下不但容易产生处理成本较高的大量废水，而且会诱发蛋白质变性，甚至生成一些有毒性化合物，严重限制了碱法蛋白提取在食品工业中的应用。为温和获得糯米大分子蛋白质，试验探究以果胶酶破壁为基础的pH值范围，对胶体磨同时提取糯米淀粉和蛋白质的影响，结果如图4所示。

图4 酶解pH值对同时提取糯米淀粉和蛋白质的影响Fig.4 Effect of enzymatic pH value on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein by colloid mill

随着pH值的升高，蛋白质提取率和淀粉得率均呈现先升高后缓慢降低的变化趋势。当pH值为4.5时，蛋白质和淀粉的同时得率最高。已有研究表明，果胶酶的最适酶作用pH值在4.0～5.0范围内［13］，此时浸泡破壁效率较高，在胶体磨处理过程中可以释放出较多的蛋白质和淀粉。当pH>5.0时，虽然谷蛋白的溶解性缓慢提高，但是果胶酶的酶活性降低，细胞间胶质的完好性限制了蛋白质的提取率，同时也导致淀粉得率降低。因此选取4.5作为最佳的酶作用pH值。

2.6 酶解温度的确定

考虑工业化生产操作适宜性，试验基于以上最优条件，选择40，50，60 ℃研究酶解温度对胶体磨同时提取糯米淀粉和蛋白质的影响，试验结果如图5所示。

图5 酶解温度对同时提取糯米淀粉和蛋白质的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

随着温度从40 ℃升温至50 ℃，蛋白质提取率和淀粉得率均呈现显著升高的变化趋势。当温度升至60 ℃时，蛋白质提取率和淀粉得率均最低。已有研究表明，果胶酶的最适作用温度为50 ℃，温度过高或过低均会抑制酶活性［14］，造成蛋白质和淀粉溶出效果的降低。糯米开始糊化的温度在60～75 ℃，温度过高时，支链淀粉溶胀，黏度增加，进一步阻碍蛋白质和淀粉的溶出。过高的温度不利于提取，因此最佳的酶解温度为50 ℃。

3 结语

本文提出酶法辅助胶体磨偶联离心处理同时制备糯米淀粉和蛋白质的新工艺，基于果胶酶破壁和水提工艺，最大限度保留产品的营养性质。进行单因素优化试验可知，选用果胶酶对糯米（料液比1：10）进行浸泡处理，酶添加量为0.8%，酶解时间60 min，酶解pH值为4.5，酶解温度为50 ℃时，蛋白质提取率可达43.8%，淀粉得率可达93.2%，达到预期目标，可为后续产业化生产提供数据支撑和依据。