全基因组测序在环境样本新型冠状病毒检测中的应用#

简洁 蒋家俊 陈璐莹 刘小华 李婉宜 许燕 周琳琳

（1. 贵阳市疾病预防控制中心检验科，贵州 贵阳 550000；2. 四川大学华西基础医学与法医学院病原生物学系，四川 成都 610000）

2020 年初湖北武汉新冠疫情阻击战胜利之后，我国新型冠状病毒肺炎（COVID‑19）疫情防控工作步入常态化，多地相继出现散发、聚集或多点散发聚集疫情。现场和分子流行病学调查分析显示，引起这些疫情的新型冠状病毒（SARS‑CoV‑2）均由境外输入[1]。截至2022 年1 月12 日，全球范围内由新型冠状病毒（SARSCoV-2）感染导致的肺炎确诊病例（新冠病例）共计314385600 例，死亡病例高达5524795 例，我国累计确诊病例134636 例，现有确诊病例6737例，累计死亡病例5699 例，新型冠状病毒肺炎依旧是全国及全球范围内的主要公共卫生问题。

有研究报道，SARS‑CoV‑2 在体外存活时间会受到气候、光照、温度、湿度、病毒载量、物表材质等多种因素的影响[2]。疫情初期，中国疾控中心病毒所首次从武汉华南海鲜市场的两批次共585 份环境样本中，检测到 33 份新型冠状病毒核酸阳性样本，并成功从核酸阳性的环境标本中分离到病毒，证实环境样本中存在COVID – 19。另外有研究报道，在4℃的环境下，SARS-CoV-2可以存活至少14 天[3,4]。

《新型冠状病毒肺炎防控方案》（第8 版）要求对进口冷链食品及其加工、运输、存储、销售场所环境，进口高风险非冷链集装箱货物进行抽

样核酸检测，还需对设有发热门诊的医疗机构的环境定期开展核酸检测。贵阳市自2020 年2 月22 日本地新冠病例清零后，截至目前无新增本土病例。但是在环境监测过程中，共出现过2 次新冠病毒核酸RT-PCR 阳性。然而，环境样本很难通过流行病学调查追踪溯源，并且会受到疫苗接种污染的影响，无法溯源会大大影响疫情的防控，故对环境样本进行SARS-CoV-2 全基因组测序显得尤为重要。因此，我们对2 起事件共5 份标本进行了SARS-CoV-2 全基因组测序，以探索全基因组测序在检测环境标本中SARS-CoV-2 的应用，另一方面，也从分子流行病学角度为我市新冠肺炎疫情的溯源和防控工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

在贵阳市开展环境核酸监测过程中，截止2021 年11 月共发现2 次新冠病毒核酸RT-PCR阳性，样本均送至市疾病预防控制中心进行复核，复核结果也为SARS-CoV-2 核酸阳性。为了及时追踪病毒来源，为疫情防控提供科学依据，我们共选取了5 份病毒核酸载量相对较高的样本进行了SARS-CoV-2 全基因组测序。

1.2 核酸提取与SARS-CoV-2 核酸检测

采用核酸提取及纯化试剂盒（上海伯杰，磁珠法），取标本200μL 于对应孔内，使用全自动磁珠核酸提取仪（上海伯杰）进行核酸提取。利用新冠病毒核酸检测试剂（上海伯杰）对所获得的核酸进行SARS-CoV-2 RT-PCR 检测。

1.3 全基因组文库构建和测定

以提取的病毒 RNA 作为模板，使用ULSEN超高灵敏度新冠病毒全基因组捕获试剂盒（低载量）（北京微未来）、Nextera XT Library Preparation Kit（Illumina，美国）、Nextera XT Index Kit（Illumina，美国）进行文库构建。（1）使用ULSEN超高灵敏度新冠病毒全基因组捕获试剂盒（低载量）（北京微未来）对SARS-CoV-2 进行逆转录及全基因组扩增，再对扩增产物进行浓缩、纯化；（2）使用 Nextera XT Library Preparation Kit（Illumina，美国）和Nextera XT Index Kit（Illumina，美国）进行双链DNA 片段化和文库构建、纯化及均一化；（3）采用Illumina Miseq 二代测序系统、Micro Miseq 芯片及配套试剂（Illumina，美国）对构建的文库进行全基因组测序。

1.4 全基因组序列拼接与比对

使用fastp 0.20.1 对测序原始下机数据进行剪切，之后以NCBI 中的SARS‑CoV‑2 Wuhan-Hu-1（Genbank: NC_045512.2）基因组作为参考序列，使用bowtie 2 软件对剪切后的测序数据进行序列拼接，再用Picard 软件删除重复序列，最后使用samtools v1.11 和VarScan v2.4.0 软件识别宿主内的变异位点和获得样本中病毒的基因组序列。

使用 Nextclade 在线分析平台（https：//clades.nextstrain.org/）和Pangolin 在线分型平台（https：//pangolin.cog‑uk.io/）进行基因组序列比对和分型。

2 结果

2.1 样本信息

2 起事件共5 份样本。具体信息见表1。

表1 贵阳市SARS-CoV-2 核酸阳性环境样本信息

2.2 样本全基因组测序信息

5 份样本是在不同的时间进行的全基因组测序，1、2、3 号为同一批次，4 号和5 号为同一批次。以SARS-CoV-2 武汉株（NC_045512.2）为参考基因组，样本基因组覆盖度及平均测序深度详见表2。1、2、3 号的基因组覆盖度均小于50%，且2 号和3 号的测序平均深度均较小，特别是3号样本，其测序平均深度为8X。尽管1 号测序平均深度为718X，但其基因组覆盖度仅为40.21%，提示样本存在核酸降解。4 号和5 号的测序平均深度分别为894X 和598X，其基因组覆盖度分别为95.39%和93.87%，提示本次测序获得了大部分的基因序列。

表2 SARS-CoV-2 全基因组测序信息

2.3 样本中SARS-CoV-2 分型

对所得的5 条序列进行基因型分析，基于Pango 命名法，只有4 号及5 号能够判断基因型，均属于B.1.617.2.33（Lineage AY.33）进化分支，属于Delta 变异株。此进化分支最早在2020 年12月12 日出现，目前主要在丹麦、德国、瑞典、比利时和美国流行。而Nextclade 分型法，对测序质量要求更高，所获得的5 条序列均无法用该方法进行分型。由于测序质量较差，即使通过特征变异位点也无法对1、2、3 号样本进行分型。

表3 SARS-CoV-2 基因型

3 讨论

新型冠状病毒肺炎的主要传播途径为经呼吸道飞沫和接触传播，接触病毒污染的物品也可造成感染，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能[5]。故对重点场所环境物表进行新冠病毒核酸检测，能够及时发现、处置、管控零星病例及小规模聚集性疫情，防止疫情扩散，保护群众健康。此外，经过数次疫情处置和溯源工作经验的积累，坚持“人物同防”成为我国常态化阶段外防输入的重要举措[1]。

自COVID-19 在全球爆发以来，基因组测序技术以特异性高、检测速度快和低成本的优势，在疫情防控、防治等方面起到重要作用[6]。全基因组测序分析不仅有助于了解新型冠状病毒的变异情况、有更加深刻的认识病毒基因序列，还可以提高对新型冠状病毒的检出复核效能和病毒传播的追踪分析准确性[7]。任丽丽等[8]利用 Illumina NGS 的测序平台，对2019 年12 月18 日武汉市的5 例肺炎患者肺泡灌洗液( BAL) 临床标本进行实验研究，确认为新发现的病原体，即2019-nCoV。王佶等[9]利用全基因组测序，表明2020 年12 月的大连新冠疫情是一起由SARS‑CoV‑2 污染的进口冷链产品感染码头工人导致的本土疫情，在传播过程中至少形成了3 个病毒代际和3 个相对独立的传播链。

在本研究中，由于第1 起事件中的样本质量差，无法获得有效的序列进行比对和分型，故无法进行溯源，但是在吸取第1 次全基因组测序的经验后，我们在对第2 起事件中的2 个环境涂抹物进行全基因组测序时，进行了条件优化，在文库构建前再一次进行了浓缩及纯化。所以尽管前3 份标本的Ct 值与后2 份标本的Ct 值差异不明显，但是第二次测序的结果不仅能够对病毒进行分型，还能追溯病毒的潜在来源，从分子流行病学角度为我市新冠肺炎疫情的溯源和防控工作提供科学依据。

此外，由于疫苗的大规模接种，在接种环节中注射器排空气体，以及安瓿瓶和注射器内疫苗残留物的挥发，均可能产生含有大量长链核酸片断的气溶胶，污染周围环境，导致在环境监测过程中出现阳性结果。通过全基因组测序，我们能够判定对病毒进行分型和溯源，避免由于疫苗接种引起的环境阳性造成人员恐慌，浪费人力物力，同时也能够及时发现毒株的传播，及时为疫情的防控提供有力的判定依据。