N-乙酰-L-半胱氨酸通过AMPK/mTOR 途径激活保护性自噬降低青蒿琥酯诱导的胰腺癌细胞死亡

任自敬，徐红霞，李星阅，王 越，马佳佳，周佩洋

（1. 湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院；湖北襄阳 441000；2. 湖北医药学院，湖北十堰 442000）

胰腺癌(pancreatic carcinoma, PC)是一种高度恶性肿瘤，早期诊断困难，发展迅速，对多种放化疗药物不敏感，预后极差，5 年生存率不足10%[1]。目前PC是世界范围内癌症死亡的第三大主要原因，如果没有取得任何治疗进展，PC 预计到2030 年将位于第二位[1-3]，因此迫切需要新的有效治疗策略。

青蒿琥酯(artesunate, ART)是从黄花蒿中提取的有效抗疟疾成分青蒿素的衍生物，广泛用于治疗严重疟疾，在推荐剂量下无明显不良反应。研究报道，除抗疟性外，青蒿素类物质还具有广谱抗肿瘤效应的潜能[4-7]。已有研究显示，ART 可在体内、外显著抑制PC 的增殖，是一种有希望的PC 治疗药物[8-9]。ART结构中包含一个内过氧化桥键，断裂后可促进胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生。ROS介导的细胞凋亡被认为是ART 发挥效应的机制之一，但是，目前明确ART 抑制PC 的方式是非凋亡依赖性的[8,10]，其他效应机制尚不明确。

自噬是在各种压力环境下对受损细胞器和细胞成分的分解代谢过程。自噬的激活水平对细胞的存活或死亡至关重要，不足或过量的自噬水平会破坏细胞内环境平衡，促进细胞死亡。CORDANI 等[11]报道，ROS 可以作为细胞信号分子启动自噬小体的形成和降解，反过来，自噬通过清除蛋白质聚集物和受损的细胞器降低氧化损伤和ROS 水平。如上所述，ROS可以参与自噬过程，同时也受到自噬的调控。前期研究发现，ART 诱导的PC 细胞死亡在NAC 的存在下受到抑制，但在PC 细胞中ART 诱导的ROS 与细胞自噬之间的关系尚不明确，需要做进一步检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 胰腺癌细胞CFPAC-1、Capan-2 及BxPC3 购自武汉普诺赛生命科技有限公司，用10%胎牛血清（FBS）+1%青/链霉素（P/S），在饱和湿度的50 mL/L CO2培养箱培养。

1.1.2 试剂 ART 购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，NAC（N-Acetyl-L-cysteine）、3-Methyladenine（3-MA）购自Selleck 公司，胎牛血清和高糖DMEM 购自GIBCO 公司，CCK8 购自Biosharp，ROS检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，Hoechst 33342 购自上海碧云天生物技术有限公司，抗体E-cadherin、N-cadherin及Vimentin、LC3、GAPDH购自Proteintech Group 公司，腺苷酸活化蛋白激酶α（adenosine monophosphate activated protein kinase α,AMPKα）、p-AMPKα、哺 乳 动 物 雷 帕 霉 素 靶 蛋 白（mammalian target rapamycin，mTOR）、p-mTOR、p62购自美国Cell Signaling Technology 公司。

1.1.3 仪器设备 CO2细胞培养箱、超净工作台购自Thermo 公司，倒置显微镜购自Olympus 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 CCK8 检测细胞活力 收集对数期生长的CFPAC-1、Capan-2 及BxPC3 细 胞，以3 000 个/100 μL/孔接种到96 孔细胞培养板，用不同浓度的ART 单独或联合NAC、3-MA 干预48 h，每孔加入10 μL CCK8 溶 液，2 h 后 酶 标 仪 检 测450 nm 波 长 处每孔的吸光度值（A 值）。

1.2.2 Transwell检测细胞迁移能力 收集血清饥饿12 h的CFPAC-1、Capan-2细胞，以50 000个/100 μL/孔接种到Transwell（8 μm,Corning）上室，下室是600 μL含20% FBS 的培养基，24 h 后取出上室进行固定及结晶紫染色，用棉签去除未迁移细胞后，荧光显微镜下观察拍照。

1.2.3 DCFH-DA 探针检测胞内 ROS 水平 经干预后的各组细胞依据ROS 检测试剂盒说明进行检测。首先更换各组培养液为无血清DMEM，之后加入胞内ROS 检测探针DCFH-DA (dichlorofluorescin diacetate)和Hoechst 33342 共 同 孵 育15 min，最 后PBS 清洗3 次后，荧光显微镜检测拍照。

1.2.4 细胞免疫荧光检测胞内LC3 表达 经干预后的各组细胞用40 g/L 多聚甲醛固定0.5 h，用免疫染色封闭液（碧云天）封闭2 h，然后将细胞和抗-LC3抗体（1∶500）4 ℃孵育过夜，PBS 清洗3 次，后给予荧光二抗Dylight549（1∶1 000）室温避光孵育2 h，PBS 清洗3 次，用DAPI 标记细胞核，在荧光显微镜下进行检测拍照。

1.2.5 Western blotting 检测细胞中相关蛋白的表达 经干预后的各组细胞用RIPA 蛋白裂解液进行冰上裂解，后经超声破碎及12 000 r/min 离心15 min 获得细胞总蛋白，用蛋白浓度检测试剂盒进行浓度检测，各组均按30 μg 蛋白总量进行Western blotting上样电泳→封闭→一抗（1∶1 000）4 ℃孵育→二抗（1∶2 000）室温孵育→ECL 显影拍照，ImageJ 进行结果定量。

1.3 统计学分析

每个实验重复进行3 次，结果以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 7 作图及统计分析。多组间采用单因素方差分析，所有数据呈正态分布，通过t检验分析组间差异。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ART 抑 制PC 细 胞 的 生 长

为了评估ART 对PC 细胞的生长抑制作用，用6.25～400 μmol/L ART处理3种PC细胞株CFPAC-1、Capan-2及BxPC3。CCK8法检测,结果显示与对照细胞相比，ART以剂量和时间依赖性方式抑制CFPAC-1、Capan-2 细胞生长（图1A）。ART 处理CFPAC-1、Capan-2 及BxPC3 细胞72 h 半数最大抑制浓度（IC50）值分别为199 μmol/L、277 μmol/L、478 μmol/L（图1B）。与BxPC3 细 胞 相 比，CFPAC-1、Capan-2 对ART 的敏感度更高。选择200 μmol/L ART 干预PC 细胞48 h 进行后续实验。

2.2 ART 抑 制PC 细 胞 迁 移

Transwell 法检测，结果显示到ART 可以抑制CFPAC-1、Capan-2的迁移（图2A）。Western blotting检结果显示到ART 可以明显上调E-cadherin 的表达，下调N-cadherin及Vimentin的表达（图2B、图2C）。

2.3 ART 依 赖ROS 抗PC

DCFH-DA 探针测定胞内ROS 水平，通过荧光显微镜观察到ART 处理明显增加了CFPAC-1、Capan-2 细胞内ROS 的含量，并且NAC 可以逆转胞内ROS 的含量，但ART 处理BxPC3 细胞未能引起胞内ROS 明显变化(图3A、图3B、图3C)。为进一步分析ART 诱导的ROS 在其抗肿瘤过程中的作用，用NAC 联合200 μmol/L ART 处理CFPAC-1、Capan-2及BxPC3 细 胞，结 果 发 现，NAC 明 显 削 弱 了ART 对CFPAC-1、Capan-2 细胞活力的抑制(图3D)。因此，认 为ART 抑 制CFPAC-1、Capan-2 细 胞 呈ROS 依赖性。

图3 ART 通过ROS 依赖性抑制胰腺癌细胞生长Fig.3 ART inhibited the growth of pancreatic cancer cells in a ROS-dependent manner

A：CFPAC-1、Capan-2 及BxPC3 细胞用0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L ART 分别处理24、48、72 h，用CCK-8 法测定细胞活力，以3 次独立实验的均值±标准差表示。B：ART 干预72 h 后各细胞系的IC50值。

2.4 NAC 增加ART 诱导的PC 胞内自噬水平

过量的ROS会损伤细胞，增加胞内的自噬水平。通过细胞免疫荧光检测到ART 可以促进CFPAC-1、Capan-2胞内自噬小体的形成，但意外的是在NAC联合ART的干预组中观察到更多的自噬小体（图4A、图4B）。为进一步分析ART诱导的自噬在其抗肿瘤过程中的作用，本研究使用自噬抑制剂3-MA 预处理，发现抑制自噬并不影响ART 对CFPAC-1 及Capan-2 细胞活力的抑制（图4C），结果提示，ART 单独处理诱导的自噬并非其抑制CFPAC-1及Capan-2细胞生长的机制。

A：Transwell 检测200 μmol/L ART 处理抑制CFPAC-1、Capan-2 细胞的迁移；B：Western blotting 检 测CFPAC-1、Capan-2 细 胞 中E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin 的表达；C：CFPAC-1 和Capan-2 细胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 蛋 白表达的比较。*P＜0.05，**P＜0.01。

A、B：细胞免疫荧光检测CFPAC-1、Capan-2 细胞中LC3 的表达；C：给予3-MA 预处理2 h，之后ART 干预CFPAC-1、Capan-2 细胞48 h，通过CCK8 检测细胞活力变化，以3 次独立实验的均值±标准差表示。两组比较，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.5 NAC 通过激活AMPK/mTOR 信号通路增强胞内自噬水平

ART 可能诱导PC 细胞发生自噬，经Western blotting 检测，结果显示，ART可以明显升高CFPAC-1、Capan-2 细 胞p62、LC3II/I，下 调p-mTOR/mTOR的表达，证实PC 细胞中自噬效应的激活，但对p-AMPKα/AMPKα 的表达无明显影响。而NAC 可以 通 过 升 高p-AMPK α/AMPK α，进 一 步 下 调p-mTOR/mTOR 的表达，升高p62、LC3II/I，增强细胞的自噬水平（图5）。

3 讨 论

胰腺癌对多种放化疗药物不敏感，迫切需要新的有效治疗方案。ART 对多种肿瘤具有显著抑制作用，且不良反应小。已有研究证明，ART 抑制胰腺癌[8]，并呈现非caspase 依赖的凋亡途径，其抗癌机制需要进一步探究，以便了解ART 细胞毒性效应的性质和特征。与之前研究结果一致，本研究发现，ART可抑制PC 细胞增殖，但不同的PC 细胞敏感性差异较大。相对而言，ART 对CFPAC-1、Capan-2 抑制效应明显高于BxPC3 细胞。

上皮间质转化是肿瘤发生侵袭和转移的关键事件，其特征是上皮标志蛋白E-cadherin 下调，而间质标志蛋白N-cadherin 及Vimentin 上调。我们通过Transwell 及Western blotting 检测上皮间质转化相关蛋白的变化发现，ART 通过抑制CFPAC-1、Capan-2细胞的迁移，上调E-cadherin 的表达，下调N-cadherin及Vimentin 的表达发挥抑制迁移的效应。

裂解内过氧化桥键产生ROS 是ART 发挥抗癌或抗疟功能的关键[12-13]。氧化应激是ROS 产生与细胞抗氧化剂防御之间不平衡的结果。当ROS 过量产生，细胞抗氧化缓冲能力降低时，会导致细胞损伤。本研究使用ROS 荧光探针染料DCFDA 检测到ART处理后CFPAC-1、Capan-2 胞内ROS 的含量明显增高，而BxPC3 胞内ROS 的变化不明显，这可能是BxPC3 细胞对ART 不敏感的原因。NAC 可以逆转CFPAC-1、Capan-2胞内ROS的含量，且削弱了ART对CFPAC-1、Capan-2 细胞活力的抑制效果。基于上述结果，确认ART 依赖ROS 发挥抗胰腺癌的效应。

ROS 是诱导自噬的主要激活信号之一，而自噬是维持细胞稳态和氧化还原稳态的主要降解途径[14]。ROS 与自噬之间相互作用的后果可能表现在两个方面：细胞损伤或细胞存活。有研究报道，ART 通过下调HeLa 细胞的线粒体膜电位，改变细胞氧化还原状态，激活了依赖pink 的保护性自噬[15]。也有研究报道，ART 通过上调ROS，通过激活AMPK-mTORULK1 轴，诱导人膀胱癌细胞自噬依赖性凋亡[16]。然而，ART 处理PC 细胞后细胞氧化还原稳态和自噬之间的作用结果尚未清楚阐明。我们通过LC3 细胞免疫荧光及自噬相关蛋白的检测，证实ART 可以激活细胞自噬，而且自噬抑制剂3-MA 并不能削弱ART对PC 细胞的抑制效应，推测ART 诱导的自噬是细胞维持稳态的一种适应性反应。有趣的是，ART 联合NAC 处理可以促进PC 细胞形成更多的自噬小体。通过Western blotting 检测发现，NAC 联合ART处理可以激活AMPK，下调mTOR 的磷酸化，上调p62、LC3II/I、Beclin1，加剧细胞自噬水平，恢复细胞活力。AMPK 是细胞内的能量感受器，在能量缺乏时被激活，通过促进受损细胞的回收再利用维持能量稳态和细胞内环境平衡。鉴于ART 的作用靶标及ROS 主要来源都是线粒体[15]，我们推测，ART 诱导ROS 可能导致PC 细胞线粒体受损，能量供给不足，进而激活AMPK，激活胞内的保护性自噬。因此，线粒体结构、功能及胞内抗氧化分子的变化后期需要做进一步验证。

综上所述，本研究检测到ART 依赖ROS 而非自噬发挥抑制胰腺癌细胞增殖的效果，是一种有希望的胰腺癌治疗药物。NAC 通过激活AMPK/mTOR 信号通路提高胞内保护性自噬，削弱ART 抗胰腺癌作用。

A：Western blotting 检测ART 联合NAC 处理48 h 后CFPAC-1、Capan-2 细胞中p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p62 及LC3 的表达；B：CFPAC-1和Capan-2细胞中p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p62和LC3II/I蛋白表达的定量结果。两组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。