MicroRNA与生精障碍的研究进展

孙文文，阿周存

（大理大学1.基础医学院，2.农学与生物科学学院，云南大理 671003）

精子发生是一个严格控制的、多步骤的过程，涉及众多基因的表达调控。相关基因的表达调控异常会引起生精障碍。近年来大量研究表明，microRNA（miRNA）介导的转录后基因表达调控是生精过程中基因表达调控的一种重要方式，对睾丸发育和精子生成至关重要。因此，miRNA 在生精障碍中的作用受到人们的关注，成为生精障碍遗传病因学研究的一个新的领域，具有广阔的探索空间。

1 miRNA在生精过程中的调节

miRNA 是一类长度为20～25 个核苷酸的内源性非编码RNA，参与转录后基因水平的表达调控。其通过与RNA 诱导的沉默复合体（miRISC）的结合与靶mRNA 的3′-UTRs 碱基配对形成双链，造成mRNA 碎片化进而抑制靶基因翻译表达。近年来，在人类和哺乳动物研究中发现一些与精子发生相关的miRNA 基因。这些miRNA 可以调节生精过程中相关靶基因的表达，实现对整个生精过程的调控。见图1（引自HE等[1]）。

图1 miRNA调节生精过程示意图

1.1 miRNA在精原干细胞自我更新和分化过程中的作用机制

精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）是睾丸中最原始的精原细胞，其通过自我更新、增殖、分裂等环节最终形成精子细胞[2]。现在已经发现了几个调节人类SSCs 细胞的miRNA 基因，这些miRNA能通过靶向特定基因，对SSCs 增殖和DNA 的合成起调控作用。其中，miR-663a和miR-31-5p是比较明确的两个。miR-663a使NFIX基因沉默，提高Cyclin A2、Cyclin B1 及Cyclin E1 细胞周期调节因子的水平，促进人类SSCs 增殖和分化，同时抑制干细胞早期凋亡[3]。miR-31-5p具有与miR-663a相反的作用，miR-31-5p使JAZF1基因沉默，降低Cyclin A2 水平，进而降低SSCs 增殖和DNA 合成，并促进早期和晚期干细胞凋亡[4]。

除了在人类SSCs 中发现与生精相关的miRNA外，在动物模型研究中也发现了许多的与SSCs 细胞调控相关的miRNA。一些miRNA 通过影响不同的信号传导通路参与SSCs的发育调控。例如，miR-486、miR-322及miR-224分别沉默靶基因MMP2、RASSF8及DMRT1，激活WNT/β-catenin 信号传导通路，参与对SSCs 自我更新和分化的调控[5-7]；而miR-19b-3p作用于靶基因PLZF后激活Jak-Stat 信号传导通路，并通过这一信号通路调控SSCs 增殖分化过程[8]。除上述miRNA 外，还有一些miRNA 明确的靶基因，并且都能调控小鼠SSCs 的自我更新，但其调控过程中具体涉及哪些信号通路仍需进一步研究。如miR-31、miR-100、miR-125a等[9-11]。此外，有研究[12]报道miR-21也能促进水牛SSCs 的分化，但其靶基因和调控机制尚不清楚。

上述在动物SSCs 发育调控中发挥作用的miRNA 与人类SSCs 的关系还有待进一步证实，但这些miRNA 的发现为阐明人类SSCs 发育调控相关的miRNA 提供了有价值的线索。

1.2 miRNA对减数分裂及减数分裂后的调节

miRNA 在减数分裂和减数分裂后的生精细胞中发挥着重要作用。许多miRNA 基因序列在X 染色体上串联重复，形成多个独立、具有选择驱动性的miRNA 簇，导致哺乳动物X 染色体miRNA 基因密度高于常染色体[13]。在雄性哺乳动物减数分裂粗线期，X 和Y 染色体转录沉默的过程称为减数分裂性染色体失活。减数分裂性染色体失活在哺乳动物中高度保守，对雄性动物正常生精功能是必须的[14]。研究表明，X 染色体上的miRNA（也称为X 连锁miRNA）多基因家族在男性生殖细胞中比其他类型的miRNA 具有更高的表达水平[15]。在减数分裂前期，性染色体基因通过减数分裂性染色体失活在精母细胞中发生表观遗传沉默。然而，通过基因重复扩增的X 连锁miRNA 家族，却可以避免被减数分裂性染色体失活沉默并继续在精母细胞和精子细胞中表达。

为了阐明X 连锁miRNA 的功能，OTA 等[16]使用CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑系统敲除小鼠模型中连续位于X 染色体上的miR-741-3p、miR-871-3p、miR-465a-5p基因。虽然小鼠睾丸组织未发现异常，但miR-871-3p的缺失导致减数分裂在一些生精小管中停止。在培养的小鼠精原干细胞中，如果仅敲除表达最高的miR-741-3p，miR-465a-5p的表达会显著上调并成为含量最丰富的miRNA，同时mRNA 的全基因组表达水平保持不变且小鼠的生精过程正常进行。这表明与生精相关的miRNA 家族成员之间存在功能补偿，并且其靶向标志物之间存在强烈协同进化。

miR-34家族是第一个被证明为哺乳动物精子产生所必需的X 连锁miRNA。缺乏miR-34家族成员的小鼠的减数分裂不能正常进行且精子出现缺陷[17]。miR-29簇也被证明在生殖细胞减数分裂期对mRNA 靶标进行抑制，不过其靶mRNA 与miR-34簇的靶mRNA 有很大不同[18]。miR-449和miR-34簇的沉默模式相似，能够靶向多个共同mRNA。虽然miR-34或miR-449簇的缺失在雄性生殖细胞发育中都没有表现出明显的缺陷，但同时敲除这两个基因会导致小鼠减数分裂异常，引起生精障碍[19]。这说明miR-34和miR-449簇之间存在功能冗余，两者在雄性生精过程中不可或缺。

精子发生过程中所必需的过渡蛋白（TNP）和鱼精蛋白（PRM）在减数分裂特定阶段受到miRNA 转录后调控。miR-469簇以TNP2和PRM2为靶点在减数分裂起始阶段高表达，抑制粗线期精母细胞和圆形精细胞中TNP 和PRM 蛋白的表达，使圆形精细胞生长停滞[20]。miR-122a能降解TNP2转录物，其过度表达使圆形精细胞发生凋亡，进而影响精子成熟[21]。此外，RAD51和HSF2基因也是减数分裂进程中的两个重要基因，这两个基因分别是miR-10a和miR-18的靶向标志物。miR-10a和miR-18的异常将导致上述这两个靶基因表达水平改变，最终影响男性精子正常成熟[22-23]。

2 miRNA与生精障碍的关系

由于miRNA 在精子发生过程中具有重要作用，是精子生成所必需的，因此，miRNA 在男性生精障碍病因学中具有极大研究价值。目前，对miRNA 与生精障碍的关系已有了一些的研究和认识，主要集中在表达谱分析和作为特异性标志物的可行性等方面。

2.1 miRNA的表达谱研究

近年来，研究不育症患者睾丸组织或精子中miRNA 的表达谱成为了解miRNA 在生精障碍中作用的重要方式和手段[24]。例如，在睾丸组织中发现梗阻性无精子症患者与非梗阻性无精子症患者之间精原细胞、粗线期精母细胞和圆形精子具有miRNA 的独特表达谱。相应地，在患者的这3 种细胞中也发现一些miRNA 表达水平改变：精原细胞中有9 种miRNA 表达水平异常；粗线期精母细胞中有11 种miRNA 的表达水平异常；圆形精子细胞有10 种miRNA 表达水平异常[25]。分析这些miRNA 的差异性表达为进一步阐明生精障碍相关的miRNA提供了重要线索。表达谱的研究不只限于睾丸组织，在精液中也发现miRNA 表达谱的变化。例如，采用高通量测序技术分析弱精子症病例和健康男性精液中的miRNA 图谱，对比发现弱精子症男性中有18 种miRNA 的表达水平发生改变[26]。提示这些miRNA 的改变可能与弱精子症的发病有关。由于精液标本相对睾丸组织标本更容易获取，生精障碍患者精液的miRNA 表达谱的研究为寻找生精障碍相关miRNA 提供了便利。

此外，隐睾症引起的生精障碍也是男性不育的重要原因之一，但miRNA 与该疾病的关系目前尚不明确。miRNA 表达谱的研究为了解两者的关系提供了新的探索思路。例如，分析隐睾症患者睾丸组织的miRNA 表达谱，发现miR-299-5p、miR-206、miR-135a等多个miRNA 高表达，提示相关miRNA 的表达异常可能与隐睾症发病有关。

总之，对生精障碍患者睾丸组织或精子细胞的miRNA 表达谱的分析为生精障碍遗传病因学研究开辟了一个新的领域。

2.2 miRNA为生精障碍诊断的生物标志物

精液中的常规生化标志物，如酸性磷酸酶、柠檬酸、锌、果糖和α-葡萄糖苷酶，可用于诊断梗阻性生精障碍和生殖腺的功能异常。而现在对于非梗阻性生精障碍引起的不育症却缺乏用于临床检验的特异性生物标志物，因此，探索具有诊断和预测功能的非侵入分子性标志物显得尤为重要。miRNA 以非常稳定的形式存在于体液中，且具有组织特异性表达谱、序列保守性、检测扩增简单等优点[27]。这些有利条件使其成为研究男性不育症病因非侵入性生物标志物的理想候选者。

目前，已经有一些miRNA 被证实可作为潜在的生物标志物用于临床。例如，miR-34b和miR-122与其他常规检测相结合可以提高不同形式非梗阻性无精子症的诊断准确性；多变量回归分析证明miR-10b-3p和miR-34b-5p相较其他检测标志物在非梗阻性无精子症中具有更高的表达水平，两者联合使用诊断效能更高[28]。miR-I9b和LET-7a基因在少精子症不育患者中的表达水平明显高于正常个体。因此，miR-19b和LET-7a被认为是诊断少精子症的良好分子生物标志物[29]。从目前的研究情况来看，miRNA 作为生物标志物在诊断生精障碍性疾病方面有很大的潜能，但其应用于临床的条件还不完全成熟，还需要进一步的研究、筛选并优化。

2.3 miRNA的SNP与生精障碍的关系

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP）是人类基因组中最丰富的DNA变异形式，研究表明miRNA 的SNP 与多种疾病的发生有关。miRNA 基因中的SNP 可通过影响前体miRNA 的转录、前体miRNA 的加工及miRNA 与mRNA 的结合调节靶基因的表达，进而参与疾病发生[30]。因此，分析生精相关的miRNA 的SNP 也成为了解miRNA 与生精障碍性疾病的关系的重要方法。许多研究证明，一些miRNA 的SNP 与生精障碍有关。通过生物信息学分析、病例对照研究和双荧光素酶报告分析，发现miR-1302基因SNP 位点rs6631 会增加生精障碍的风险[31]。与MTHFR基因3′-UTR 结合的miR-34b的SNP 位点rs55763075 和miR-196a-2的SNPs 位点rs11614913 分别被证实是无精子症的危险因素[32-33]。最近，又发现miR-34b/c基因的SNP 位点rs4938723 的多态性与少精症相关，且SNP rs4938723 的CC 基因型可能增加少精症的发病风险[34]。该研究结果为进一步阐明miRNA 在人类生精障碍中的作用提供有价值的资料。

由于生精相关的miRNA 的SNP 可能影响miRNA 的功能，引起生精过程相关靶基因表达调控出现异常，进而影响正常生精过程导致生精障碍。因此，miRNA 的SNP 也被认为是生精障碍临床诊断的候选生物标志物。研究鉴定生精障碍相关的miRNA 的SNP 对生精障碍的临床诊断具有重要意义。

3 miRNA在生精障碍领域的展望

miRNA 对精子发生中的基因调控是男性不育症病因学研究的重大突破之一，意味着找到了除蛋白质之外的重要调控因子。miRNA 在不同生精阶段和不同类型生精障碍性疾病的差异性表达使其具有极高的特异性和敏感性，在未来男性生精障碍性疾病的分子机制研究和临床诊断与治疗上具有很大的发展空间，有望取得突破性的研究成果。