深海微生物来源细胞色素P450酶与天然产物生物合成

李 众，张镜明，李盛英，张 伟

(山东大学微生物技术国家重点实验室(微生物技术研究院)，山东 青岛 266237)

海洋作为地球上最广阔的水体，占地球表面积的71%，蕴藏极其丰富的矿产和生物资源，其中大部分(超过95%)为水深超过200 m的黑暗、缺氧、寡营养、高压、高盐、低温或高温(热泉)的深海环境[1-3].尽管深海属于极端生境，但深海生态系统蕴藏了丰富的生物多样性，如深海海绵、珊瑚、藻类等动植物以及数以万计的微生物.为了适应严苛的深海生态系统，在长期进化过程中，深海生命获得了显著不同于其他生境(如陆地和近浅海)生命形式的特殊遗传背景、新颖生理代谢途径和化学防御策略.这些独特的生命特征和生命活动过程赋予了深海生物产生天然产物的化学结构、生物活性和生物合成过程的复杂性和新颖性[2,4-5].

天然产物是动植物和微生物等生物产生的有机化合物的统称，其数量庞大，结构丰富，生物学功能多样，包括蛋白质、糖类、脂肪酸类、萜类、多肽类和生物碱等结构类型，被广泛地应用于人类生产生活的方方面面[6-7].自Alexander Fleming从青霉菌(Penicilliumsp.)中发现青霉素(penicillin)以来，微生物天然产物吸引了药学家和化学家的浓厚兴趣，且在过去的一个多世纪一直是研究热点，如日本科学家Satoshimura和美国科学家William C.Campbell因从阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)中发现杀虫农药阿维菌素(avermectin)荣获2015年诺贝尔生理与医学奖[8].微生物产生的具有丰富生物活性的天然产物是其进行化学防御、排除异己的重要“武器”，不仅为药物研发提供了丰富的先导化合物来源，也是化学合成以及改造修饰的重要骨架资源.2020年，David J.Newman和Gordon M.Cragg撰文统计了1981—2019年间美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准上市的1 881个新药，其中，约46%的药物来源于天然产物及其衍生物，且以抗生素和抗肿瘤药物为主[9].

面对肿瘤等恶性疾病发病率的提高、致病菌的耐药性问题日趋严重、新型致病病毒的不断出现等危害个人及公共卫生安全的严峻考验，人类对新型活性天然产物的需求更加迫切，科学家们也逐渐将目光投向深海微生物资源及其独特的天然产物合成能力[5,10].目前，已发现的深海微生物来源的天然产物的结构类型丰富，如萜类、聚酮类、非核糖体肽类及生物碱等；且具有多样化的生物活性及显著的药用潜力，如抗真菌、抗细菌、抗肿瘤、抗疟原虫及抗病毒等[2,5].因此，海洋微生物作为海洋生物资源的重要组成部分，是海洋先导分子和新型药物的重要来源，其在海洋药物研发过程中具有重要地位.深海来源活性天然产物的独特生物合成机制也吸引了科学家们的关注，以期阐明其生物合成过程，挖掘获得新颖的酶学催化元件，为利用合成生物学技术对天然产物的结构进行理性设计和改造、改善其药学性质、产生具有更好成药性的“非天然”天然产物提供支持[11-12].

一般而言，微生物天然产物的生物合成主要分为3个阶段：1)前体供应阶段.微生物通过初级代谢或环境摄取获得天然产物合成所需的骨架原料、能量和金属离子，如氨基酸、丙二酸及其衍生物、还原型辅酶Ⅰ(reduced nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)和镁离子等.2)骨架形成阶段.前体物质经骨架合成酶的识别、激活、装载后，通过连续缩合或环化过程形成相应天然产物结构类型的核心骨架，代表性的骨架合成酶有非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)、聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)、萜类合酶(terpene synthase，TS)等.3)后修饰阶段.天然产物生物合成后修饰酶通过立体、区位选择性地催化复杂天然产物的官能化反应，如氧化酶(细胞色素P450酶、黄素依赖型加氧酶、α-酮戊二酸依赖型双加氧酶等)、糖基转移酶、酰基化酶、甲基转移酶、卤化酶等，极大地拓宽了天然产物的结构复杂性和生物学功能多样性.当然，也存在诸多修饰酶在骨架形成阶段完成“线上修饰”，或在前体供应阶段参与非天然氨基酸或脂肪酸等衍生物的生物合成[13].

参与天然产物生物合成后修饰途径的诸多氧化酶中，细胞色素P450酶分布最为广泛，功能最为吸引人.细胞色素P450酶为一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白超家族，因其还原态与一氧化碳结合后的紫外-可见光谱在450 nm处具有最大吸收值而得名[14-15].P450酶的血红素铁基团通过轴向保守半胱氨酸连接到脱辅基蛋白上，这是其特征光谱吸收的结构基础.自从P450作为一种色素从大鼠肝微粒体发现以来，关于P450酶的研究已有60余年的历史[16].截至2021年10月，已有超过50万个编码P450酶的基因序列被UniProt数据库收录.且P450基因被发现广泛存在于人类、动物、植物、微生物甚至病毒中，展示了它们在自然界中的多样性[17].P450酶具有催化反应类型和底物结构类型多样的特点，在天然产物生物合成、异源物质降解、类固醇激素生物合成和药物代谢等诸多方面扮演着重要角色[7,18-22](图1).因此，开展对P450酶学及酶工程的研究，对于绿色可持续催化及应用具有重要的理论和实践意义.

图1 细胞色素P450酶的应用领域

P450酶被认为是万能生物催化剂[23]，可在温和条件下高选择性地催化底物进行不同类型的氧化反应，除常见的羟基化、环氧化等反应类型外，还包括脱羧、N/O-脱烷基、硝基化、C—S成键、C—C偶联及断裂反应、螺环形成、C—N成键及C—N键去饱和等20多种非常规反应，极大地拓宽了天然产物的化学空间[7,20,22,24-25].此外，P450酶的底物结构类型几乎涵盖了自然界中发现的所有天然产物结构类型，如萜类、聚酮类、脂肪酸、生物碱和多肽化合物等.由于大部分天然产物的化学骨架是由C—H键所构筑形成的，P450酶能够实现对惰性C—H键的选择性氧化活化，为改造天然产物结构及改善其水溶性、提供可修饰基团，进而改变其生物活性提供了重要选项和关键解决策略.

在P450酶的结构、功能、酶工程改造等领域有许多出色的综述总结[21,24]，本课题组长期从事P450酶学与酶工程研究，在该领域开展了具有重要推动作用的工作，例如：首次发现了P450酶催化功能的可塑性[26]，系统性地提出了P450氧化还原伴侣(redox partners)的选择性准则[27]，提出CYP152家族催化机制新见解[28]，阐明了多种细菌、真菌P450酶在天然产物合成过程中的功能及催化机制[29-34].基于上述研究，本课题组先后撰写了多篇P450酶与天然产物生物合成相关的综述：曾在NaturalProductReports杂志上两次以封面文章的形式阐述了负责微生物天然产物中常规及非常规反应的P450酶的来源、功能及催化机制[7,22]；系统概述了P450酶与微生物药物创制[35]、P450酶催化系统的工程化改造及其在生物医药和生物技术领域中的应用[36]、P450酶的催化功能及其在生物合成和有机合成中的应用[37]；综述了参与脂肪酸生物合成的P450酶学及酶工程的研究进展[38]；总结并展望了氧化还原伴侣与P450酶的相互作用及其对P450酶功能调控的重要作用[39].本文则聚焦于深海来源微生物天然产物生物合成中的P450酶，以期为深海来源的P450酶的发掘、工程化改造以及功能研究和潜在应用提供借鉴.

1 细胞色素P450酶的催化循环

一般而言，P450单加氧酶都需要氧化还原伴侣传递从NADH或还原型辅酶Ⅱ(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)获得的2个电子到亚铁血红素反应中心实现氧分子的激活，其中一个氧原子参与形成一分子的产物水，另一个氧原子则修饰C—H键形成氧化基团.P450酶有一个共同的、复杂的催化循环过程，以典型的羟基化反应为例(如图2所示，反应通式：R—H+O2+H++NAD(P)H→R—OH+NAD(P)++H2O)，概述P450酶的催化机制[36,40].首先，处于静息态的P450酶(A)通常接受底物RH，RH取代活性部位的水分子，但不直接与铁结合；与底物结合的高自旋配合物B的三价铁FeⅢ被氧化还原伴侣传递来的一个电子还原为亚铁FeⅡ(配合物C).随后，一分子氧气与FeⅡ结合形成[FeⅡO2]的复合物D，复合物D接收来自氧化还原伴侣传递来的第2个电子从而被还原为复合物E，复合物E从水溶液中获得一个质子生成[FeⅢ-OOH]的复合物F(Cpd 0)；Cpd 0的O—O键在获得第2个质子后异裂，释放出一个水分子，生成含高价卟啉自由基阳离子四价铁[FeⅣO]的复合物G(Cpd Ⅰ)；这种反应性极强的复合物G从底物中夺取一个氢原子，从而形成复合物H(CpdⅡ).接着，底物自由基与复合物H的羟基发生反应得到复合物I.最后，羟化产物ROH从复合物I中解离并且水分子重新与FeⅢ配位，P450酶恢复到静息态A.当底物分子再次结合到P450酶血红素中心的活性位点时，重复启动相同的催化循环.值得一提的是，P450酶也可以利用过氧化氢作为电子供体从而走“捷径”来形成Cpd 0，进一步形成CpdⅠ来完成底物催化.除依赖过氧化氢的P450过加氧酶(如CYP152家族)外，对于大多数P450单加酶来说，其对过氧化氢的耐受性差且过氧化氢途径的催化效率低，限制了该策略在P450酶催化反应中的应用.

图2 P450酶催化的C—H键选择性氧化反应循环过程

2 深海微生物来源天然产物生物合成过程的P450酶

目前，已鉴定的深海微生物来源的P450酶，主要参与聚酮类、非核糖体肽类及聚酮-非核糖体肽杂合类天然产物的生物合成过程.其催化反应类型包括羟基化、环氧化、酮基化、硝基化、桥醚键构筑、C—N成键反应等，展现了P450酶在深海活性天然产物的骨架构筑、结构修饰及活性提升中扮演着至关重要的角色.

2.1 聚酮类天然产物生物合成中的P450酶

聚酮类化合物(polyketide)是一种由模块化的聚酮合酶生物合成得到的天然产物，是重要的微生物次级代谢产物结构类型，具有抗肿瘤、降血脂、杀菌等生物活性[41-42].如来自土曲霉(Aspergillusterreus)的降血脂药物洛伐他汀、大环内酯类抗生素(红霉素、利福霉素、泰乐菌素等)、免疫抑制剂(雷帕霉素和FK506)、杀虫剂(阿维菌素和南昌霉素)、抗癌药物(光辉霉素和多柔比星).聚酮类化合物骨架多样性主要源于模块式的Ⅰ型聚酮合酶、迭代式的Ⅱ型聚酮合酶和含可重复进行缩合反应的酮基合成酶结构域的Ⅲ型聚酮合酶[41].值得一提的是，聚酮类化合物的生物合成过程中，往往存在P450酶催化反应的踪影.

heronamide类化合物拥有独特的膜结合能力，并且可能影响细胞形态[43-44].Zhu等[45]报道了分离自印度洋孟加拉湾的一株深海(3 412 m)链霉菌Streptomycessp.SCSIO 03032的聚酮类化合物heronamide F的生物合成基因簇及生物合成途径.为了研究heronamide F生物合成基因簇中编码P450酶的基因herO的功能，他们首先基于同源重组的策略构建了herO的阻断突变株，经发酵和产物鉴定后发现其主要积累由8个Ⅰ型聚酮合酶(Her-A1A2BCDEFG)顺序加载装配、环化释放的8-脱氧-heronamide F.为进一步验证HerO的体外功能，他们将HerO与本课题组开发的来自红球菌(Rhodococcussp.)NCIMB 9784的伴侣蛋白RhFRED融合得到HerO-RhFRED，在添加NADPH或NADH作为电子供体时，特异地催化8-脱氧-heronamide F的C-8位羟基化反应，得到heronamide F(图3(a)).以上体内外实验证实，HerO是负责催化8-脱氧-heronamide F羟基化反应的关键氧化酶[45].

abyssomicin是一类结构新颖的多环聚酮类化合物，具有丰富的药理活性[46-47].从深海来源的链霉菌S.koyangensisSCSIO 5802中分离得到多个abyssomicin类化合物，如具有增强人淋巴中免疫缺陷病毒Ⅰ型复制的neoabyssomicin A和C[48]，抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的abyssomicin 2、neoabyssomicin F和G二聚体[49].通过全基因组测序、生物信息学分析、基因敲除及异源表达等手段，Tu等[50]初步完成了S.koyangensisSCSIO 5802中neoabyssomicin/abyssomicin生物合成基因簇的鉴定及生物合成机制推测：3个Ⅰ型聚酮合酶AbmB1～AbmB3负责C16的聚酮链的生物合成，进一步在AbmA1～AbmA5等作用下连接C3结构单元并环化得到独特的tetronate环；最终经第尔斯-阿尔德反应、氧化反应得到含独特桥醚环结构的abyssomicin 2.

L-pip.L-(4-羟基化)六氢哒嗪酸.

除此之外，Zhang等[52]针对深海来源的橄榄链霉菌(S.olivaceus)SCSIO T05的全基因组分析发现了一条聚酮类化合物lobophorin CR4的生物合成基因簇，簇内包含了一个可能参与其生物合成过程的P450基因lbpP1，但其具体的催化功能尚无相关生物信息学分析及实验证据.

2.2 非核糖体肽类天然产物生物合成中的P450酶

非核糖体肽类经由一类模块化的NRPS生物合成得到，其生物活性丰富，如抗菌剂(万古霉素、短杆菌素、达托霉素、棘白霉素类药物等)、免疫抑制剂环孢菌素、抗肿瘤药物罗米地辛等[53].一个基本NRPS模块主要由负责识别激活氨基酸的腺苷酰化结构域(adenylation domain)、挂载肽链的肽酰载体蛋白结构域(peptidyl carrier protein domain，PCP)和催化氨基酸之间形成肽键的缩合结构域(condensation domain)组成[54-55].在非核糖体肽类天然产物生物合成过程中，既有负责修饰氨基酸前体产生非天然氨基酸的P450酶，也有以NRPS加载产生环肽骨架再进行后修饰的P450酶[7].

Ma等[56]从深海来源的链霉菌S.atratusSCSIO ZH16发酵产物中获得6个怡莱霉素化合物(ilamycins B1、B2、C1、C2、D、E1)，从其突变株中分离得到怡莱霉素E2和F1.怡莱霉素类化合物也可以通过抑制来自结核分支杆菌(Mycobacteriumturberculosis)中靶标蛋白ClpC1的活性从而造成胞内代谢紊乱，进而发挥抗结核活性[57]，其中怡莱霉素E对结核分支杆菌 的最小抑制浓度可达9.8 nmol/L，目前已完成该抗结核化合物的成药性评价，展现了其在结核病治疗中的应用前景；怡莱霉素C和E可通过不同的途径引起三阴乳腺癌细胞凋亡[58-59].

从结构上分析，怡莱霉素是由7个氨基酸组成的环肽，结构中含有罕见的L-2-氨基-4-己烯酸、3-硝基-L-酪氨酸和异戊烯基化的色氨酸结构单元.根据怡莱霉素的结构特征，通过生物信息学分析、基因敲除、前体饲喂、同位素标记等多维策略，确定了负责怡莱霉素的生物合成基因簇和从异戊烯基化的色氨酸出发的NRPS骨架结构生物合成过程[56].

在怡莱霉素的生物合成过程中共有4个P450酶的参与，Ma等[56]对它们进行了细致的生物信息学分析及体内功能阐明，2个P450酶(IlaD和IlaN)负责非天然氨基酸前体的生物合成，另外2个P450酶(IlaL和IlaR)则负责怡莱霉素中亮氨酸末端甲基的羧基化及异戊烯基的环氧化，具体如下(图3(c))：1)通过敲除编码Ⅰ型聚酮合酶的基因ilaE或编码P450酶的基因ilaD，发现突变株均无法产生怡莱霉素，饲喂L-2-氨基-4-己烯酸后突变株可恢复怡莱霉素的生成；饲喂13C标记的乙酸钠，发现分离获得的怡莱霉素中L-2-氨基-4-己烯酸中的碳信号出现增益，充分说明IlaE负责其聚酮链的生物合成，P450酶IlaD则催化挂载于酰基载体蛋白(acyl carrier protein,ACP)的己烯片段的α-位四电子连续氧化成酮基，随后经转氨酶IlaH的催化形成α-氨基并由Ⅱ型硫酯酶IlaF水解释放.2)敲除怡莱霉素生物合成基因簇中的一氧化氮合酶基因ilaM和P450酶基因ilaN，突变株均丧失怡莱霉素的合成能力，回补3-硝基-L-酪氨酸使得怡莱霉素的生产得以恢复，说明它们参与到L-酪氨酸的硝基化过程.其中，IlaM负责催化精氨酸释放一氧化氮；P450酶IlaN则继续以一氧化氮和色氨酸作为底物，实现色氨酸苯环上的硝基化反应，其催化机制很可能类似于thaxtomin生物合成过程中的P450酶TxtE[60-61].3)P450酶基因ilaL的阻断突变株主要积累NRPS IlaS负责合成的怡莱霉素B1及环氧化产物B2，表明P450酶IlaL负责催化亮氨酸末端甲基连续氧化成羧基.4)P450酶基因ilaR被阻断后，突变株中则主要积累怡莱霉素B1、E1、E2和F，即不再产生环氧异戊烯基怡莱霉素，表明IlaR负责环氧基团的生成.其中，怡莱霉素E1和E2是IlaL氧化怡莱霉素B1形成的中间体经自发的C—N成键形成六元环后产生的.

随后，基于链霉菌S.atratusSCSIO ZH16的全基因组信息及次级代谢产物生物合成基因簇的分析，Sun等[62]成功激活其中一个非核糖体肽类天然产物基因簇，并获得了含肉桂酸结构单元的atratumycin类化合物.活性测试表明atratumycin对致病菌结核分枝杆菌展现出较好的抑制活性，可在微摩尔级发挥效用.相应的基因敲除及突变体发酵产物分析发现，atratumycin主要经由3个NRPS(Atr21～23)共7个模块负责合成，其由一分子邻甲基肉桂酸和甘氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-缬氨酸、L-脯氨酸、D-天冬酰胺及2S,3S-3-羟基苯丙氨酸共10个氨基酸组成.敲除NRPS基因atr23和P450酶基因atr27，突变株均无法生物合成atratumycin.他们进一步尝试利用来自聚球藻的氧化还原伴侣组合Fdx_1499/FdR_0978和菠菜的氧化还原伴侣组合spFdx/spFdR来体外重建Atr27对L-苯丙氨酸的催化反应活性，发现Atr27无法催化L-苯丙氨酸的羟基化反应[62].以上体内/体外实验结果表明Atr27很可能是在NRPS合成线上实现苯丙氨酸的选择性羟基化反应(图3(d)).

Zhou等[63]从我国南海深海(1 396 m)沉积物中分离得到的链霉菌S.drozdowicziiSCSIO 10141的发酵液中分离得到6个新环肽类化合物，命名为甲哌霉素(marformycins)A～F，其结构骨架主要由一分子L-苏氨酸、L-亮氨酸、N-甲基-缬氨酸、(4-羟基化)六氢哒嗪酸(piperazic acid)、D-别异亮氨酸或D-缬氨酸、O-甲基-D-酪氨酸、L-别异亮氨酸或L-缬氨酸共7个氨基酸所组成.体外活性测试发现甲哌霉素A～E对条件致病菌藤黄微球菌(Micrococcusluteus)具有较好的抑制活性且无显著的细胞毒性.随后，Liu等[64]对S.drozdowicziiSCSIO 10141进行全基因组测序并获得含20个开放阅读框(open reading frames,ORFs)的长约45 kb的甲哌霉素生物合成物基因簇mfn，并结合基因敲除实验完成了对该基因簇的功能鉴定.甲哌霉素的骨架由5个NRPS(MfnC、MfnD、MfnE、MfnK和MfnL，累计7个模块共26个结构域)通过连续的氨基酸识别、修饰、缩合并释放得到.他们敲除编码P450酶的mfnN基因发现突变株无法产生甲哌霉素C、D和E，主要积累甲哌霉素A、B和F，暗示P450酶MfnN可能以释放后的环肽骨架作为底物，催化六氢哌嗪酸的4-位选择性羟基化反应(图3(e)).但目前不能排除识别六氢哌嗪酸的腺苷酰化结构域具有宽泛的底物特异性，能够同时识别羟基化和非羟基化六氢哌嗪酸作为底物并加载到结构骨架中；或者腺苷酰化结构域识别非羟基化的六氢哌嗪酸并装载到ACP结构域后，由MfnN催化装配线上的羟基化.因此，该P450酶的具体反应机制还需更进一步的体外实验证实.

来自深海放线菌MarinactinosporathermotoleransSCSIO 00652的methylpendolmycin 和pendolmycin为含吲哚结构的内酰胺类化合物.其中，methylpendolmycin具有抑制佛波酯(phorbol ester)与蛋白激酶C结合的生物活性[65]；pendolmycin则可抑制人皮肤鳞癌细胞A431中表皮生长因子诱导的磷脂酰肌醇周转[66].Ma等[67]通过对M.thermotoleransSCSIO 00652的基因组测序及生物信息学分析定位，锁定了methylpendolmycin/pendolmycin的生物合成基因簇；采取逐一敲除核心基因mpnABCDEF的策略结合蛋白质同源比对分析，完成了生物合成基因簇mpn中关键基因功能的解析.作为双模块的NRPS蛋白，MpnB首先激活L-异亮氨酸或L-缬氨酸，且其甲基化结构域(methylation domain)催化该氨基酸的N-甲基化，第2个模块激活装载L-色氨酸并催化其与L-异亮氨酸或L-缬氨酸的缩合得到二肽结构骨架；P450酶MpnC则催化该二肽分子内(化合物9)的C—N键(非常规P450酶反应)形成；最后，经异戊二烯基转移酶MpnD的催化得到相应的终产物(图3(f)).MpnC的催化机制很可能与参与indolactam V生物合成的P450酶TleB(来自链霉菌S.blastmyceticus)和HinD(来自Streptoalloteichushindustanus)一致，即P450酶通过3种可能的中间体完成C—N成键反应：1)催化底物N-甲基-L-缬氨酸-L-色氨醇形成苯环双键环氧化中间体；2)催化底物上仲胺基团脱氢形成氮自由基；3)催化底物上仲胺基团及苯环脱氢形成双自由基中间体[68].

Fan等[69]和Liu等[70]从一株深海来源的真菌Dichotomomycescejpii中分离获得了一系列胶霉毒素(gliotoxin)类化合物.胶霉毒素是经NRPS途径生物合成得到的含二硫桥的二酮哌嗪化合物，具备多种生物活性，如免疫抑制活性和细胞毒性等.胶霉毒素的生物合成途径在烟曲霉(Aspergillusfumigatus)中得到初步解析[71].通过基因组测序和生物信息学分析，Ye等[72]在D.cejpii基因组中锁定了胶霉毒素的生物合成基因簇gli，结合已鉴定的同源基因簇中的基因功能，推测P450酶GliF可能参与环二肽骨架中苯丙氨酸和丝氨酸α-位碳原子的羟基化反应以及后续的非常规C—N成键反应(图3(g)).

2.3 聚酮-非核糖体肽杂合类天然产物生物合成中的P450酶

聚酮-非核糖体肽杂合类天然产物是由PKS和NRPS共同负责核心骨架的生物合成.其中，NRPS的缩合结构域往往负责实现氨基酸与装载在PKS上的酰基结构单元之间的缩合反应；相应的骨架进一步通过以P450酶为代表的后修饰酶完成氧化、C—C成键、C—N成键等修饰作用[73].该类化合物具有良好的生物活性，在临床上应用广泛，典型的代表如雷帕霉素(rapamycins)、埃博霉素(epothilones)等.

多环特特拉姆酸大环内酰胺(polycyclic tetramate macrolactams，PTMs)是一类母核结构经PKS-NRPS杂合途径生物合成由特特拉姆酸(tetramic acid)结构和多环体系(常为2～3环)构成的内酰胺类化合物，具备抗肿瘤、抗细菌、抗真菌等生物活性[74].Hou等[75]前期通过培养条件优化的策略从来自中国南海深海的链霉菌S.somaliensisSCSIO ZH66中分离得到的新PTM类化合物somamycin A～D，对植物致病真菌以及肿瘤细胞具有不同程度的抑制活性，且抑制活性优于阳性对照抗生素制霉菌素.基于全基因组数据及生物信息学分析成功地鉴定了somamycin的生物合成基因簇ptm，但其中预测为P450酶的编码基因orf7的功能并未得到阐明.该课题组的最新研究[76]发现，通过同源重组的策略敲除ptm中的orf7后，突变株中主要积累somamycin D但无法产生somamycin C，因此，Orf7很可能负责骈环结构的氧化修饰，即负责将somamycin D的14-位羟基进一步氧化为羰基(图3(h)).

Ding等[77]针对深海来源的S.koyangensisSCSIO 5802的生物信息学分析发现了一条PKS-NRPS杂合的长度约16 kb的生物合成基因簇sko，通过基因敲除实验发现其负责10-epi-HSAF(10-epi-heat-stable antifungal factor)和一个新的PTM类化合物koyanamide A的生物合成.该基因簇sko中存在一个推测编码P450酶的基因skoE，可能参与koyanamide A中的[4+4]环加成反应，但目前仍缺乏相应的体内或者体外生理生化的实验证据(图3(i)).已鉴定的参与天然产物生物合成的深海来源P450酶汇总于表1.

表1 已鉴定的参与天然产物生物合成的深海来源P450酶

除以上概述的结构类型外，在深海链霉菌生物碱类化合物的生物合成基因簇中也发现了P450酶基因的踪迹.Ma等[78]在研究一株来自深海的链霉菌Streptomycessp.SCSIO 03032中产生的具有抗菌、抗肿瘤活性的吲哚咔唑类生物碱spiroindimicins的生物合成机制时发现，P450酶编码基因spmP位于编码chromopyrrolic acid 合成酶的关键基因spmD的下游.尽管SpmP与已鉴定的参与吲哚咔唑类生物碱星形孢菌素(staurosporine)生物合成的P450酶StaP的相似度达到57%，但有趣的是，敲除spmP并未影响Streptomycessp.SCSIO 03032中spiroindimicins的生物合成，暗示着SpmP可能不参与其生物合成或者簇外存在功能补偿的冗余P450酶编码基因.

3 总结与展望

长期以来，深海探测采样和原位培养等技术手段的匮乏极大地限制了人们对深海生物资源的开发利用.近年来，随着科学家们针对深海来源天然产物的化学生物学以及生态学研究的逐步深入，若干P450酶被发现参与它们的生物合成过程，呈现出多样化的催化反应类型(羟基化、酮基化、C—N成键、硝基化等)，丰富了现有的P450酶天然资源库(图4).鉴于深海环境的独特性，深海来源的P450酶可能具有耐盐(比如来自咸海鲜球菌(Jeotgalicoccussp.ATCC 8456)的P450酶OleTJE便展现出中度嗜盐的特性[79])、抗逆性强等诸多特性，这为P450酶工程改造及生物催化应用提供了很好的候选酶.

图4 深海来源P450酶的一般研究策略及潜在意义

随着深海探测技术和宏基因组测序的长足进步，NCBI数据库(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中P450酶的编码基因数量呈现急剧增长的态势，其中包含数量可观的深海来源的真菌、细菌乃至病毒的P450酶编码基因[54]，展示了深海P450酶库开发和研究的无穷潜力.目前，深海来源P450酶的研究主要集中于放线菌来源，特别是侧重于天然产物生物合成过程中P450酶的生理生化功能研究，而催化机制和结构生物学的研究相对滞后.形成鲜明对比的是，深海真菌、藻类及动物来源P450酶的研究则较为稀缺，对于一些参与异源毒素降解或者孤儿P450酶(Orphan P450)的生物学功能探究更是匮乏.

从长远发展来看，对于深海P450酶的挖掘、功能鉴定及潜在应用的探索和研究仍需要多学科的交叉融合、相辅相成(图4)：1)设计、开发精良的深海装备，促进对深海生物资源的可持续开发及获取；2)不可培养的深海微生物获得以及原位培养技术的突破；3)结合表观遗传修饰、大规模发酵、全基因组测序、沉默基因激活等不同的分子生物学和遗传学技术，实现含P450酶基因的天然产物生物合成基因簇的功能研究；4)宏基因组测序结合生物信息学分析，获取深海环境中的P450酶基因并构建相应的数据库，结合α-fold等蛋白三维结构预测技术进行同源建模和功能预测；5)针对具备工业应用价值的P450酶，开展结构生物学、计算生物学、定向进化等方面的研究，从而实现高活性和高选择性P450酶的研制以适应产业的需求.相信通过对深海来源P450酶的多维研究，将极大地丰富对P450酶参与天然产物生物合成过程中的功能认识，进一步充实P450生物催化元件库而助力合成生物学和相关工业领域的发展.