TGF-β1介导的Smad和ERK信号通路在肾纤维化中的研究进展

郭 帅 方 敬 陈志强 （河北中医学院，石家庄 050000）

肾纤维化是慢性肾脏疾病的最终共同途径，以细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度沉积为主要特征，与患者的长期预后密切相关。TGF-β1是目前公认的最强的致纤维化生长因子之一，可以通过增加ECM 合成，抑制ECM 降解，促进肾细胞与基质的黏附，引起炎症细胞的浸润，介导肾固有细胞的凋亡、肥大、脱离及表型转换等导致肾纤维化。TGF-β1 所介导的信号通路分为Smad 依赖途径及Smad 非依赖途径，其中Smad 非依赖途径以ERK 信号通路为主。TGF-β1/Smad 及 TGF-β1/ERK 信号通路相互交叉协作调控靶基因转录及蛋白表达，诱导肾纤维化。

1 TGF-β1

TGF-β1是TGF-β超家族的成员，其家族还包括骨形态发生蛋白、生长分化因子、米勒抑制物质、抑制素、活化素等［1］。TGF-β 是一种广谱生长因子，可调节许多基本的生物学过程，包括细胞生长、分化、黏附、增殖组织修复和凋亡。在哺乳动物中存在TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3 3 种亚型。TGF-β1 是与肾纤维化最相关的亚型，可由所有类型的肾细胞和浸润炎症细胞分泌。细胞分泌的TGF-β1 都是以无活性的潜活 TGF-β1 复合物（LTGF-β1）形式存在，这种复合物主要包括潜活相关蛋白（LAP）、成熟TGF-β1 多肽和TGF-β1 结合蛋白（LTBP），当暴露于各种刺激［包括pH值、活性氧、纤溶酶、组织蛋白酶、整联蛋白和血小板反应蛋白（TSP）-1等］，TGF-β1从潜在复合物中释放出来，成为有活性的TGF-β1，与其细胞表面受体结合［2］。TGF-β1 受体属于跨膜蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶家族，有3种类型，TGF-βⅠ型受体（TβRⅠ）、Ⅱ型受体（TβRⅡ）和Ⅲ型受体（TβRⅢ），其中TβRⅠ和TβRⅡ是TGF-β信号通路激活的必需分子。成熟的TGF-β1与TβRⅡ结合以募集TβRⅠ，启动Smad 依赖性和Smad 非依赖性信号途径，介导生物学效应［3］。

越来越多的证据表明，TGF-β1在实验性动物模型和人类肾纤维化中发挥重要作用，TGF-β1在纤维化肾脏中均显著上调，且与原发病无关。TGF-β1诱导肾脏纤维化的主要机制包括：①诱导Ⅰ型及Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白（FN）等ECM 的合成［4-5］；②减少金属蛋白酶（MMP）的合成和增加金属蛋白酶抑制剂的合成来抑制ECM 降解［6］；③诱导肾系膜细胞、上皮细胞及内皮细胞肥大、增殖、凋亡、脱离等［7］；④促进成纤维细胞、周细胞、上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞等向肌成纤维细胞转分化［8-9］；⑤改变整联蛋白的表达并调节其在细胞表面的相对比例，促进细胞与ECM的黏附［10］。

2 TGF-β1/Smads信号通路与肾纤维化

Mad 蛋白和Sam 蛋白同处于丝氨酸/苏氨酸激酶受体下游，因此将Mad 蛋白和Sam 蛋白及其类似物统称为 Smad 蛋白。Smad 是 TGF-β1 信号转导过程中重要的胞内下游分子，将TGF-β1 信号由膜受体传导至细胞核，调控靶基因的转录。在哺乳动物中已发现8 种Smads，根据结构和功能可分为：①受体 激 活 Smads（R-Smads），包 括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 和 Smad8；②普通 Smads（Co-Smads），包括 Smad4；③抑制性 Smads（Ⅰ-Smads），包括Smad6 和 Smad7。Smad2、Smad3、Smad4 和 Smad7 参与TGF-β1 信号通路。TGF-β1 与 TβRⅡ结合激活TβRⅠ，导致Smad2 和Smad3 磷酸化，激活的Smad2和Smad3与Smad4形成复合物，易位到细胞核中，调节靶基因的转录。Smad7 是Smads 家族中的抑制性蛋白，由TGF-β1诱导产生，在正常情况下，Smad7可以通过竞争TβRⅠ、阻止Smad2/3 磷酸化、招募E3连接酶Smurf1/2 或Nedd4-2 到TβRⅠ致TβRⅠ的泛素化降解等多种方式，阻止TGF-β1 信号通路的过度活化，从而起到负反馈的作用。

TGF-β1/Smad 信号通路与肾纤维化密切相关。TGF-β1/Smad信号的激活显著促进了肾小球硬化和肾小管间质纤维化［11］。Smad2 和 Smad3 在实验性动物模型和人类肾纤维化中均被过度激活［12-13］。多项研究表明，Smad2 和 Smad3 在 TGF-β1 介导的信号通路中具有相反的功能。在不同病因所引起的肾纤维化模型中，敲除Smad3 基因可以明显缓解肾纤维化程度［14］。Smad3 的过表达抑制成纤维细胞中MMP-1的活性［15］。Smad3可以直接结合到胶原蛋白的启动子区域以诱导其合成［16］。以上研究均表明Smad3 具有致病性。虽然Smad2 和Smad3 的结构具有90%以上的相似性，但Smad2 在肾纤维化中起保护作用。敲除Smad2 基因加重了UUO 小鼠的肾纤维化，而Smad2 的过表达减弱了肾小管上皮细胞中TGF-β1 诱导的Smad3 磷酸化和Ⅰ型胶原蛋白的表达［17］。Smad4 是将 Smad2/3 易位到细胞核中的关键分子。在小鼠及细胞实验中，敲除Smad4基因，均可减轻ECM 的积累。进一步的研究表明，敲除Smad4基因是通过降低Smad3 反应性启动子活性并抑制Smad3 与 Col1A2 启动子的结合而减弱肾纤维化［18］。Smad7是TGF-β1信号通路重要的负反馈调节因子，在纤维化肾脏中，Smad7 的水平明显降低［19］。体内外实验均表明，Smad7 基因过表达能抑制TGF-β 介导的肾纤维化，而Smad7 基因敲除加重肾纤维化［20-21］。以上研究结果表明，Smad2和Smad3既有共性又有其各自起作用的方式，在肾纤维化中的作用不尽相同，有待进一步研究。Smad4促进肾纤维化，Smad7 抗肾纤维化。总之，Smad 依赖的信号通路在传导TGF-β1信号介导肾纤维化中发挥重要作用。

3 TGF-β1/ERK信号通路与肾纤维化

细胞外信号调节激酶（ERK）属于丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPK）。MAPK 是一个在真核生物中保守性很高的蛋白丝/苏氨酸激酶家族，调控着代谢、基因表达、增殖、运动等多种细胞活动。迄今为止，已在哺乳动物中鉴定出5 种不同的MAPK：细胞外信号调节激酶 1 和 2（ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶 1、2 和3（JNK1/2/3）、p38、ERK3/4 及 ERK5。研究最广泛的是ERK1/2、JNK1/2/3和p38激酶。尽管每个MAPK 都有独有的特征，但有相同的信号传导模式，每个MAPK 家族都由一组3 个顺序起作用的激酶组成：MAPKK 激酶（MAPKKK）、MAPK 激酶（MAPKK）和MAPK。MAPKKK 是丝氨酸/苏氨酸激酶，活化的MAPKKK 可磷酸化MAPKK 而将其激活，活化的MAPKK 将 MAPK 磷酸化而激活，活化的 MAPK 可以转位至细胞核内，通过磷酸化作用激活多种关键酶、转录因子等，使细胞对外来信号产生生物学应答。

ERK 是较大的丝裂原活化蛋白激酶家族的成员。ERK1 和ERK2 的结构有84%相同，因此，常使用ERK1/2 进行指代。ERK1/2 调节细胞周期进程、增殖、胞质分裂、转录、分化、衰老、死亡、迁移、GAP连接形成、肌动蛋白、微管网络、神经突延伸和细胞黏附等。ERK1/2 信号的畸变已被广泛用于多种疾病，包括多种癌症、糖尿病、病毒感染和心血管疾病等。MAPK 可以被生长因子、细胞因子、激素、高渗、压力及理化刺激等激活，但一般来说，ERK1 和ERK2 会优先响应生长因子被激活［22］。细胞外生长因子（如表皮生长因子EGF、血小板衍生因子PDGF等）与其各自的跨膜受体酪氨酸激酶（RTK）结合后形成二聚体，激活受体酪氨酸激酶活性，受体自身络氨酸残基磷酸化，形成SH2 结合位点，结合含有SH2 结构域的接头蛋白 Grb2，Grb2 的 2 个 SH3 结构域与SOS 分子中的脯氨酸序列结合，SOS 活化之后SOS 结合 Ras 蛋白，促进 Ras 释放 GDP、结合 GTP，Ras-GTP 可引起 Raf（MAPKKK）、MEK（MAPKK）和ERK（MAPK）的顺序募集和激活。Raf 的激活机制非常复杂，需要Ras 的结合、多次磷酸化/去磷酸化事件及Raf 二聚体的形成，至今尚未完全阐明［23］。Raf是一组丝氨酸/苏氨酸激酶（A-Raf、B-Raf、C-Raf），其中C-Raf 是研究最广泛也是功能最多的激酶，其调节作用复杂且仍待阐明［24］。活化的Raf 与双特异性激酶MEK（MEK1、MEK2）结合并使其磷酸化，继而在其活化环保守的Thr-Glu-Tyr（T183-E-Y185）基序内使ERK 磷酸化。尽管MEK1和MEK2具有广泛的同源性，但研究表明，MEK1 激活的ERK2 优先聚集在细胞核中［25］。然后，活性 ERK1/2 从 MEK1/2 中释放出来，可以易位进入细胞核或在细胞质中磷酸化100多种具有多种功能的底物［26］。

ERK 信号通路是TGF-β 介导肾纤维化的另一重要信号通路。与前文所介绍的RTK 类似，被活化的TβRⅡ-TGF-β1-TβRⅠ三聚体在Tyr和Ser上募集并直接磷酸化ShcA，触发了与Grb2 和SOS 的缔合，从而激活了Ras-ERK 途径。然而，有研究表明，在成纤维细胞中，TGF-b 激活Erk 途径与经典的Ras/Raf/ERK 途径并不同，Ras 可能仍参与其中，但起次要作用，C-Raf 激活主要通过 Pak2 发生［27］。大量研究表明，ERK 信号通路在不同原因所致的肾纤维化动物模型及人类中呈激活状态，抑制该通路可以缓解肾纤维化［28-29］。ERK 途径可通过抑制肾小管EMT改善肾间质纤维化［30］。TGF-β1 通过 ERK1/2 途径，导致肾小管细胞胶原沉积和肾纤维化。TGF-β1 可激活体外培养的足细胞ERK1/2，并诱导间质MMP-9的表达和活化，导致基底膜的损伤，最终引起肾小球硬化［31］。ERK1/2 抑制剂 PD98059 可以抑制鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子的表达，从而减轻肾纤维化［32］。以上研究结果表明，TGF-β1通过活化ERK 信号通路介导肾小管上皮细胞EMT，增加ECM的分泌，抑制ECM 的降解，促进肾纤维化。总之，TGF-β1/ERK 信号通路在肾纤维化中作用不容忽视。

4 TGF-β1 介导的 Smads 和 ERK 信号通路在肾纤维化中的相互关系

TGF-β1 既能诱导经典的 Smad2/3 信号，又能诱导非经典的C-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号，2条信号通路相互作用产生细胞增殖、分化、迁移、生长停滞、凋亡和上皮间质转分化等多种生物学反应［33-34］。已有大量研究表明，Smad 与ERK 信号转导之间的存在串扰。有研究发现，TGF-β 诱导的ERK 信号通路可促进Smad2/3磷酸化［35］。另外，TGF-β诱导的Ras/ERK MAPK 信号诱导 TGF-β1，并放大 TGF-β 反应。Ras-ERK途径与TGF-β协同诱导Smad依赖的Snail1表达，这是EMT 通过抑制E-钙黏着蛋白表达所必需的［36］。进一步研究表明，在 Smad2 和 Smad3 的连接子区域内，有几个潜在的ERK 磷酸化位点，ERK 介导的接头区域磷酸化增加了受体磷酸化的Smad2和Smad3 的半衰期，而且还增加了Smad 转录活性的持续时间［27］。Smad2/3 的快速磷酸化，可被 ERK1/2 或p38MAPK抑制剂阻断［37］。以上结果均表明，TGF-β1介导的ERK 信号和Smad 信号之间是相互协同的。但也有一些研究有相反的意见，表型正常的间充质细胞中发现了TGF-β 诱导的ERK 激活，但在正常的上皮细胞中没有发现［27］。ERK 会磷酸化Smad2/3的接头区域，该区域被TGF-β 激活，从而抑制了Smad2/3 的核转运和 Smad 的依赖性转录［38］。在原代培养的肺泡上皮细胞及其细胞系中，Ras-ERK 通路会干扰 TGF-β1 诱导的 Smad 信号介导的 EMT［39］。磷酸化的连接子区域，还显示出抑制Smad核易位和信号传导［40］。以上研究引起本课题组进一步思考，可能 TGF-β1/ERK 途径对 TGF-β1/Smad 的正负调控作用因细胞类型而产生差异，但具体的分子机制仍需深入研究。

图1 TGF-β1介导的Smad和ERK信号通路在肾纤维化中的作用Fig.1 Role of Smad and ERK signaling pathway mediated by TGF-β1 in renal fibrosis

5 结语

综上所述，TGF-β1 所介导的 Smad 信号和 ERK信号从多个方面参与了肾纤维化的形成。2 条通路并不是简单的线性传导，而是受到多种蛋白的调控，且通路之间相互作用，使机制变的更为复杂。虽然目前已经开发了TGF-β1、Ras、Raf、MEK和一些下游靶标的抑制剂，但许多抑制剂仍在临床试验中。因此应对TGF-β1 信号深入研究，揭示TGF-β1/Smads和TGF-β1/ERK信号通路间的本质联系，认识到机制的关键，开发特定的抑制剂，造福于肾纤维化患者。