基于NF-κB信号通路探讨鼻渊合剂对急性鼻窦炎的作用机制

肖佳宁,薛珊珊,倪平敏,王卓,吴拥军

(南京中医药大学附属医院/江苏省中医院,江苏 南京 210029)

急性鼻窦炎(Acute sinusitis,ARS)是由炎症浸润改变和(或)破坏鼻腔鼻窦局部和(或)整体免疫功能导致的上呼吸道感染性疾病[1],其炎症浸润多为病原菌感染引起,常见的潜在致病菌包括金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌等[2]。鼻渊合剂是国医大师干祖望教授在经典名方“苍耳子散”和“苇茎汤”基础上加减化裁而成的临床经验方,采用现代提取工艺制备而成的江苏省中医院院内制剂,组成包括白芷、苍耳子、桔梗、芦根、桑叶、辛夷、鱼腥草。

前期临床研究证实[3]，鼻渊合剂能显著降低ARS患者外周血中性粒细胞/淋巴细胞比值,改善鼻塞和头面部胀痛,具有良好的临床疗效。进一步在体动物实验研究[4]发现,其机制可能与促进IL-10分泌、抑制IL-9和p38 MAPK通路、调控免疫平衡相关。另外,据报道p38 MAPK可磷酸化IκBα,使IκBα与NF-κB解聚,激活NF-κB,调控IL-9等多种细胞因子产生[5]。因此,本文将利用网络药理学研究方法,从药物有效活性成分、疾病靶点、关键基因、代谢通路、生物功能等多层面探讨鼻渊合剂治疗ARS的作用机制,并通过建立ARS大鼠模型,对网络药理学筛选出的信号通路进行实验验证。

1 材料

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黄色葡萄球菌-标准菌种,购自上海鲁微科技有限公司。

1.1.2 动物 SD大鼠36只,体质量200～240 g,雌雄各半,由浙江省实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK (浙)2019-0002。

1.1.3 药物 鼻渊合剂水煎液(批号：1708024,生药量:0.7 g·mL-1);阿莫西林克拉维酸钾分散片(7∶1)(鲁南贝特制药有限公司生产,批号:H20050586，规格：0.228 5 g×24粒)、桉柠蒎肠溶软胶囊(北京九和药业有限公司,批号:20170612,规格:0.3 g×12粒)等。

1.1.4 试剂 吸收性明胶海绵 (江西省祥恩医疗科技有限公司)、PBS缓冲液、5×蛋白上样缓冲液、显影液、BSA、甲醇、异丙醇等其他实验室常规材料。IL-8试剂盒(上海纪宁生物公司,货号:1617168302685997265),IL-1β试剂盒(武汉华美生物公司,货号:CSB-E08055r),IL-6试剂盒(武汉华美生物公司,货号:CSB-E04640r),TNF-α试剂盒(武汉华美生物公司,货号:CSB-E11987r)。

2 方法

2.1 鼻渊合剂活性成分筛选及靶点预测

以白芷、桑叶、芦根、桔梗、苍耳子、辛夷、鱼腥草等中药为关键词,通过TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php)提取鼻渊合剂中各药味成分,以口服生物利用度(OB)>30%和类药性(DL)>0.18为标准筛选获得有效活性成分和相应的靶基因,并利用Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)对靶基因进行标准化处理。

2.2 ARS相关基因的收集

以“acute sinusitis”为关键词,通过GeneCards(https://www.genecards.org)数据库提取获得ARS相关靶基因信息,并应用Venny绘制与鼻渊合剂作用靶基因交集的靶基因,最终获得鼻渊合剂治疗ARS的靶基因。

2.3 构建“药物-活性成分-靶点”网络

将上述鼻渊合剂中药、活性成分、与疾病相关基因导入Cytoscape软件(Version 3.7.2),构建药物-活性成分-靶点网络,并计算节点的网络度(degree),度值越大对应的节点面积越大,则表示该节点的生物功能越广泛。

2.4 构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络

将筛选出的药物基因与疾病基因分别输入Cytoscape上的插件“Bisogenet”中,选择基因识别和蛋白互作,同样将蛋白种类设置为 “Homo sapiens”,其他参数保持默认。使用Network工具得出两者的交集后行拓扑分析,以明确作用的主要靶基因。

2.5 GO分析和KEGG通路分析

将药物基因与疾病基因的交集基因导入Metascape(https://metascape.org/gp/index.html/main/step1),物种设置为“Homo sapiens”,而后自定义选择中依次设置“KEGG Pathway”和“GO Molecular Function(MF)”,其余选项均为默认值不变,进行计算。

2.6 金黄色葡萄球菌菌液制备

常规复苏金黄色葡萄球菌-标准菌种,需氧环境下37 ℃培养24 h后,挑取小部分菌落于无菌试管中保存,菌液调至4麦氏浊度,即每管中金葡菌菌液浓度为1.2×109CFU·mL-1。

2.7 中药水煎液制备

鼻渊合剂水煎液由南京中医药大学附属医院(江苏省中医院)制剂室,按照国家标准制剂工艺制成4倍浓缩药液,浓缩液生药含量为2.8 g·mL-1,同时与生理盐水以1∶1配成2倍浓缩药液,含量为1.4 g·mL-1,4 ℃保存备用。

2.8 ARS大鼠模型制备

随机挑选32只SD大鼠,按100 g大鼠腹腔注射0.3 mL 10%水合氯醛溶液进行全身麻醉。大鼠固定后,将吸收性明胶海绵裁剪成2 mm×5 mm×10 mm大小塞入大鼠右侧鼻腔内,再向鼻腔内滴入0.5 mL 1.2×109U·mL-1金黄色葡萄球菌。

2.9 动物分组及给药

根据鼻窦炎症状评分标准[4],选取评分≥6分的大鼠,即造模成功的ARS大鼠,随机分为:模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组和西药组,每组各6只,雌雄各半。空白组6只,雌雄各半。

每日给药:空白组不给药,其余各组药液均以5 mL·kg-1·d-1灌胃。模型组:生理盐水灌胃;高剂量组、中剂量组、低剂量组分别以鼻渊合剂4倍、2倍、1倍浓度水煎液灌胃；西药组:阿莫西林克拉维酸钾和桉柠蒎肠溶胶囊，参照临床用药与动物实验换算标准,每日以相当于临床成人剂量的6.25倍溶入生理盐水灌胃,即阿莫西林克拉维酸钾给药量为95.2 mg·kg-1、桉柠蒎肠溶胶囊给药量为62.5 mg·kg-1。每日1次,持续给药1周。末次给药24 h后麻醉取股动脉血5 mL,离心提取血清,于-80 ℃存放。取血后处死大鼠,沿大鼠鼻中隔切开1.5 cm,取出大鼠右侧鼻窦黏膜,一分为二置于2个2 mL离心管中,一半标本经4%中性甲醛液固定后于4 ℃保存,另一半直接置于-80 ℃冰箱存放。

2.10 观察指标

2.10.1 大鼠鼻部症状评分标准 在造模完成后第1天和造模完成后第7天,根据ARS症状评分标准记录大鼠症状评分,见表1。造模成功标准:模型大鼠活动量较正常大鼠明显减少,出现清涕或浊涕,鼻前庭潮红等症状评分≥6分。

表1 ARS症状评分标准Table 1 Symptom scoring criteria of ARS

2.10.2 血清IL-1β、IL-6、IL-8及鼻窦黏膜组织TNF-α表达检测 取大鼠血清、部分鼻窦黏膜,采用ELISA试剂盒检测血清中IL-1β、IL-6、IL-8及鼻窦黏膜中TNF-α水平,检测使用Multiskan FC型酶标仪(赛默飞世尔科技公司)，具体步骤严格按照试剂盒说明执行。

2.10.3 鼻窦黏膜中NF-κBp50和NF-κBp65检测 取出鼻窦黏膜组织,加入预冷的玻璃研磨器中,充分研磨后冰水裂解,离心后去上清移至新的EP管中。将0.5 mg·mL-1BSA(牛血清白蛋白)标准品按梯度稀释加到96孔板的标准品孔中,同时加入染色液。室温放置后,用酶标仪测定A595(595/630 nm)的吸光度,根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。在蛋白样品中加入蛋白上样缓冲液,水浴加热。将样本冷却到室温后,进行上样、电泳、封闭,先后行一抗、二抗孵育,最后将蛋白曝光、显影。

2.11 统计学方法

数据采用SPSS22.0统计分析软件进行处理,符合正态分布及方差齐使用t检验,方差不齐使用校正t检验,P<0.05为差异有统计学意义。蛋白条带应用Quantity One、Gel pro analyzer、Image J等软件对各条带进行定量分析。

3 结果

3.1 鼻渊合剂有效成分和靶基因

经筛选去重获得鼻渊合剂处方中66个有效活性成分,并根据“Related Targets”,筛选去重得靶基因239个,见表2。

表2 药物有效活性成分数及作用基因数Table 2 Drugs and active ingredients and their oral bioavailability and drug like properties

3.2 获取ARS关键基因

GeneCards检索获得2 236个ARS相关基因,然后取其与上述鼻渊合剂去重后药物靶基因的交集,得到141个交集基因,为鼻渊合剂治疗ARS的关键基因,见图1。

图1 中药复方鼻渊合剂与ARS共有靶点图Fig.1 Common target of BYHJ and ARS

3.3 构建“药物-活性成分-靶点”网络

将各数据导入Cytoscape中并绘制图形,建立“药物-活性成分-靶点”网络,见图2。同时由网络计算出的“Degree”值前五位:槲皮素 (Quercetin)为146、山柰酚(Kaempferol)为60、β-谷甾醇(β-Sitosterol)为38、氧血根碱 (Oxysanguinarine)为38、豆甾醇(Stigmasterol)为34。

图2 药物-活性成分-靶点网络图Fig.2 Network diagram of "Drug-Active ingredient-Target"

3.4 构建PPI 网络

下载分析所得数据,截取出大于“Degree”两倍中位数48的值。而后重新计算再截取出同时大于介数(Betweenness)中位数801.812、贴进度(Closeness)中位数0.476、度值(Degree)中位数81的数据,建立PPI网络,见图3。前5位分别为淀粉样β前体蛋白2 134、高亲和力神经生长因子受体1 574、泛素连接酶947、细胞肿瘤抗原946、表皮生长因子受体931。

图3 PPI网络分析Fig.3 PPI network

3.5 GO MF分子富集分析

选择前20个作条形图展示,见图4。鼻渊合剂主要参与的生物过程包括对炎症反应的调节、对伤害的反应、对细胞外刺激的反应、对脂多糖的反应、对生长因子的反应、对肿瘤坏死因子的反应等。

图4 GO分子功能富集分析Fig.4 GO MF enrichment analysis

3.6 KEGG通路富集分析

截取出前20个相关通路作条形图展示,见图5,可见鼻渊合剂治疗ARS的信号通路包括NF-κB信号通路、癌症的途径、钙信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。

图5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

鉴于网络药理学研究显示NF-κB信号通路与ARS具有高相关性,实验相关通路图如图6,标蓝为此次动物实验中检测指标。

图6 NF-κB信号通路图Fig.6 NF-κB signaling pathway diagram

3.7 血清、黏膜各指标检测结果

模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8及鼻窦黏膜内TNF-α表达量较空白组显著上升(P<0.01),给药后西药组、高剂量组、中剂量组、低剂量组表达量均下降(P<0.01),见表3;与空白组比较,模型组鼻窦黏膜中NF-κBp50、NF-κBp65蛋白含量水平升高,各给药组均较模型组下降(P<0.01),BYHJ高剂量组与西药组下降程度接近,见图7。

表3 各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8及鼻窦黏膜内TNF-α表达量比较Table 3 Expression comparison of IL-1β、IL-6、IL-8 and TNF-α in each

注：与空白组比较，**P<0.01;与模型组比较，图7 Western blot法检测鼻窦黏膜中NF-κBp50、NF-κBp65蛋白水平Fig.7 The expression of NF-κBp50、NF-κBp65 protein in each group

4 讨论

ARS属于中医鼻渊范畴,《素问·气厥论》对鼻渊的论述奠定中医对鼻渊病机的基本认识[6]。干祖望教授根据长期临床经验,总结出鼻渊由外感风寒,入里化肺热,内蕴窦腔,腐蚀肌膜,酝酿成脓所致,认为“风寒化肺热”为中医病因病机实质,治拟疏风清热、通窍排脓[7],以鼻渊要药白芷、辛夷、苍耳子宣通鼻窍、消肿排脓,合桑叶、桔梗、鱼腥草清热排脓,再添千金苇茎汤中的芦根,旨在清肺热,增强排脓之效,方用鼻渊合剂。已有研究报道[8]白芷可显著降低溃疡性结肠炎大鼠体内IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平以及调节NF-κB信号通路,从而改善大鼠症状。桔梗中桔梗总皂苷可抑制NF-κB信号通路的激活,促进组织修复,从而减轻炎症反应[9]。研究[10]还证实大鼠胎盘经桑叶中桑叶总黄酮干预后,组织中NF-κB蛋白表达量显著降低,发挥抗炎和抗氧化应激作用,同时鱼腥草中新鱼腥草素钠[11]也有降低NF-κB蛋白表达量的作用。根据研究显示[12],前炎症因子IL-1β作为ARS的重要炎症递质,IL-1β增加不仅会磷酸化 p38 MAPK,还能激活NF-κB信号转导通路,引发白细胞募集,同时诱导巨噬细胞活化,造成组织细胞凋亡,并向核区转位,翻译和转录炎症因子,促进IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子的产生[13-15],加剧局部炎症反应和气道重塑[16]。

本实验中动物实验结果显示,与空白组相比,模型组血清中IL-1β、IL-6、IL-8含量水平显著升高,同时鼻窦黏膜中NF-κBp50、NF-κBp65蛋白、TNF-α的表达水平也有所升高。与模型组相比,中西药各组表达水平均有所下降,且高剂量组各数据水平与西药组基本接近。表明鼻渊合剂能显著降低ARS模型大鼠体内NF-κB信号通络相关炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平,同时通过调控NF-κBp50、NF-κBp65含量,起到抗炎作用,与网络药理学分析结果呈一致性。

综上所述,网络药理学分析结果显示鼻渊合剂通过NF-κB信号等通路治疗ARS，而动物实验进一步验证了鼻渊合剂对于炎症的抑制作用。本课题组后续将对NF-κB信号通路中的其他上、下游调控因子以及网络药理学挖掘的其他可能作用机制等深入研究,进一步揭示鼻渊合剂对ARS的作用机制。