lncRNA FOXD2-AS1靶向miR-1299抑制口腔鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

林方梁 张杰 曾丽霞 杨正涛 王东

口腔鳞癌是临床口腔科常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率呈逐年升高的趋势。临床主要采用手术、放疗、化疗等方式进行治疗，但有数据显示口腔鳞癌患者复发率较高且生存率较低[1,2]。靶向治疗方法开辟了口腔癌治疗的新途径[3]。有研究报道longnon-codingRNA，lncRNA和微小RNA(microRNA，miRNA)均参与调控口腔鳞癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等多种生物学过程，可将其作为口腔鳞癌早期诊断、治疗和预后的分子生物学标志[4-7]。但lncRNAFOXD2-AS1是否可通过调控miR-1299表达从而影响口腔鳞癌细胞增殖及凋亡，目前笔者查阅文献后发现仍尚未可知。因此本实验研究lncRNAFOXD2-AS1靶向miR-1299调控口腔鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的体外研究，为揭示口腔鳞癌发生及发展的分子机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 口腔鳞癌细胞CAL27、SCC-090、HSC-3购自上海冠导生物工程有限公司；正常人口腔角质细胞NHOK购自上海宾穗生物科技有限公司；qPCR试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自杭州仟诺生物科技有限公司；BCA试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Transwell小室、Matrigel胶购自美国BD公司；AnnexinV-FITC/PI试剂盒购自北京博尔迈生物技术有限公司。

1.2 细胞处理与分组 人口腔鳞癌细胞株CAL27、SCC-090、HSC-3和正常人口腔角质细胞NHOK在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养，条件37℃、5% CO2；取对数生长期细胞CAL27，将FOXD2-AS1干扰表达载体、FOXD2-AS1干扰对照载体、FOXD2-AS1过表达载体、FOXD2-AS1过表达对照载体、miR-1299模拟物、miR-1299模拟物对照质粒分别转染至细胞中，分别记为si-NC组、si-FOXD2-AS1组、pcDNA-NC组、pcDNA-FOXD2-AS1组、miR-NC组、miR-1299组；将FOXD2-AS1干扰表达载体分别与miR-1299抑制剂、miR-1299抑制剂对照质粒转染至细胞中，记为anti-miR-NC+si-FOXD2-AS1组、anti-miR-1299+si-FOXD2-AS1组。

1.3 qPCR检测lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299的表达 提取各组细胞的总RNA，利用RNA试剂盒合成cDNA，根据qPCR试剂盒加入试剂，并在PCR仪上进行荧光定量。lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299分别以GAPDH和U6为内参。lncRNA FOXD2-AS1上游引物：5’-CCGCGTAAGCCTCATAGAAG-3’，下游引物：5’-GGGAGTAGGGTGAGGAAAGG-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-1299上游引物：5’-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，下游引物：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAG-3’；GAPDH上游引物：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物：5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’。引物由上海生工生物工程公司合成。lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299相对表达量用2-△△Ct法计算。

1.4 CCK-8检测细胞增殖能力 各组细胞培养48 h后，制成密度为1×104个/ml的单细胞悬液，接种于96孔板中，加入10 μl CCK-8试剂/每孔，37℃孵育2 h，酶标仪检测每孔450 nm处光密度值(OD)。将OD值转换成细胞存活率。

1.5 Annexin V-FITC和PI染色实验检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h后，以1×105个/孔接种于96孔板中，调整细胞密度至1×106个/ml，1×结合缓冲液重悬，分别加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI。流式细胞仪检测凋亡情况。

1.6 Western blot检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3、β-catenin蛋白表达 各组细胞培养48 h后，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳后，用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上。室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜；加入二抗(1∶2 000稀释)，室温孵育2 h，放入ECL显色液中显色15 min，应用Image Pro Plus软件分析蛋白条带的灰度值。

1.7 双荧光素酶报告实验检测lncRNA FOXD2-AS1对miR-1299的靶向作用 构建野生型和突变型基因靶点荧光素酶表达载体WT-FOXD2-AS1和MUT-FOXD2-AS1，用LipofectamineTM2000将WT-FOXD2-AS1和MUT-FOXD2-AS1分别与miR-NC和miR-1299共转染至CAL27细胞中，检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 正常口腔角质细胞与口腔鳞癌细胞中lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299的表达 与正常人口腔角质细胞NHOK相比，口腔鳞癌细胞CAL27、SCC-090、HSC-3中lncRNAFOXD2-AS1表达水平显著升高，miR-1299表达水平显著降低(P<0.05)。选择差异最明显的CAL27细胞用于后续实验。见表1。

表1 正常口腔角质细胞与口腔鳞癌细胞系中lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299的表达情

2.2 低表达lncRNA FOXD2-AS1对CAL27细胞增殖和凋亡的影响 与si-NC组比较，si-FOXD2-AS1组细胞中lncRNA FOXD2-AS1表达水平显著降低，CyclinD1表达水平、细胞存活率显著降低，Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1。

表2 低表达lncRNA FOXD2-AS1对CAL27细胞增殖和凋亡的影响

图1 低表达lncRNA FOXD2-AS1对CAL27细胞增殖和凋亡的影响；A 细胞凋亡图；B 蛋白表达图

2.3 高表达miR-1299对CAL27细胞增殖和凋亡的影响 与miR-NC组比较，miR-1299组细胞中miR-1299表达水平显著升高，CyclinD1表达水平、细胞存活率显著降低，Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3，图2。

表3 高表达miR-1299对CAL27细胞增殖和凋亡的影响

图2 蛋白表达图

2.4 lncRNA FOXD2-AS1与 miR-1299结合位点 结果显示lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299有靶向关系。与miR-NC组相比，细胞转染WT-FOXD2-AS1后，miR-1299表达水平显著降低(P<0.05)；细胞转染MUT-FOXD2-AS1后，miR-1299表达水平无显著变化(P>0.05)。与si-NC组相比，si-FOXD2-AS1组miR-1299表达显著升高(P<0.05)，与pcDNA-NC组相比，pcDNA-FOXD2-AS1组miR-1299表达显著降低(P<0.05)。见表4、5，图3。

表4 双荧光素酶报告实验

表5 qPCR检测miR-1299的表达

图3 lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299结合位点图

2.5 低表达miR-1299可以逆转FOXD2-AS1低表达对口腔鳞癌细胞CAL27增殖和凋亡的影响 与anti-miR-NC+si-FOXD2-AS1组相比，anti-miR-1299+si-FOXD2-AS1组细胞中miR-1299表达水平显著降低(P<0.05)，CyclinD1表达水平、细胞存活率显著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6，图4。

表6 低表达miR-1299可以逆转FOXD2-AS1低表达对口腔鳞癌细胞CAL27增殖和凋亡的影响

图4 蛋白表达图

2.6 Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达 与si-NC组相比，si-FOXD2-AS1组β-catenin表达水平显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC+si-FOXD2-AS1组相比，anti-miR-1299+si-FOXD2-AS1组β-catenin表达水平显著升高(P<0.05)。见表7，图5。

表7 Western Blot检测β-catenin蛋白表达

图5 蛋白表达图

3 讨论

口腔鳞状细胞癌是发生在口腔黏膜中最常见的恶性肿瘤，约占头颈部恶性肿瘤的40%[8]，由于口腔鳞癌具有较强的侵袭和转移复发特点，其治疗效果不佳，给人类的生命健康带来严重的威胁[9]。因此，寻找影响口腔鳞癌发生发展的分子机制是靶向治疗口腔鳞癌关键[10]。lncRNA和miRNA参与癌症细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等过程，并可参与癌症的发生发展过程。研究表明lncRNA可通过调控miRNA参与口腔鳞癌的发生发展过程[11,12]。

本实验结果表明，口腔鳞癌细胞中lncRNA FOXD2-AS1表达水平显著升高，当lncRNA FOXD2-AS1低表达时，CyclinD1表达水平、细胞存活率显著降低，Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率显著升高。类似的研究已有报道。彭科瑜等[13]研究表明，lncRNA FOXD2-AS1通过靶向负调控miR-324-5p的表达影响结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。王婷等[14]研究表明，lncRNAFOXD2-AS1通过靶向miR-506-5p调控宫颈癌细胞增殖与凋亡。上官文兵等[15]研究表明，lncRNA FOXD2-AS1具有调控胶质瘤细胞增殖及迁移的能力。

本实验结果发现，口腔鳞癌细胞中miR-1299表达水平降低，当miR-1299高表达时，，CyclinD1表达水平、细胞存活率显著降低，Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率显著升高。且本实验还发现，低表达miR-1299可以逆转lncRNA FOXD2-AS1低表达对口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的影响。类似的研究已有报道；如Meng等[16]研究表明，miR-1299可促进食管鳞状细胞癌细胞自噬。郭艳等[17]研究表明，miR-15b具有调控口腔鳞癌细胞增殖与凋亡能力；李击等[18]研究显示，miR-17-5p在口腔鳞状细胞癌中有表达。

本实验结果表明，低表达miR-1299逆转了lncRNAFOXD2-AS1低表达对β-catenin表达的抑制作用。lncRNAFOXD2-AS1可能通过调控miR-1299影响Wnt/β-catenin信号通路的激活水平。类似的研究已有报道；如苏文等[19]研究表明，β-catenin信号通路影响口腔鳞状细胞癌的生物学行为；陈顺金等[20]研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在口腔鳞癌干细胞的迁移、侵袭及EMT转化中起调控作用。

综上所述，干扰lncRNAFOXD2-AS1表达可能通过上调miR-1299抑制Wnt/β-catenin信号通路从而抑制口腔鳞癌细胞增殖，促进细胞凋亡。