基于网络药理学和分子对接探讨真武汤治疗扩张型心肌病的作用机制

孙斯嘉，冼绍祥，杨忠奇，尹克春，袁天慧

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一种以心室扩大和心肌收缩功能降低为特征的异质性心脏病，临床上常可引起心力衰竭、心律失常和猝死[1]。由于扩张型心肌病初诊后5年内病死率高，以及可能需要进行心脏移植，对社会和家庭造成了巨大的经济负担[2]。

黄春林教授认为，本病的主要病机为本虚，在于心、肾、脾阳虚，涉及气、血、水三者病变，主张结合现代医学研究治疗，在通阳化气的基础上，将本病分为心气虚弱、阳气虚脱、阳虚水泛、水气凌心、痰热困肺、心脉不整、心血瘀阻7种证型，其中阳虚水泛证，治以温阳利水，多用真武汤加减，黄春林教授在运用真武汤加减治疗扩张型心肌病时，还特别注重心肾并调，气血水同治，故临床疗效尤为显著[3]。鞠静等[4]研究表明，真武汤能够明显改善病人心脏功能，减轻临床症状及并发症，提高生活质量，且优于单纯西药治疗。李峥等[5]通过观察真武汤对转基因扩张型心肌病小鼠心肌组织Atp2a2、Col1a1基因及蛋白的表达变化，得出真武汤能明显上调转基因扩张型心肌病小鼠心肌组织中Atp2a2 mRNA及蛋白表达，下调Col1a1 mRNA及蛋白表达，结果表明真武汤通过抑制心肌细胞凋亡、抑制心肌纤维化，改善心室重构，进而改善心功能，达到治疗扩张型心肌病的作用。虽然，目前单一药物及靶点模型研究已取得了较大成功，但同时也存在局限性，由于疾病在病理上是与多种途径、多种基因及多种蛋白的相互作用，因此，在许多情况下，治疗是无法通过靶向单一通路或基因、蛋白来实现的[6]。本研究借助网络药理学及分子对接的方法，旨在通过研究疾病、药物、靶点和作用途径之间的复杂多样关系，为进一步探讨真武汤治疗扩张型心肌病提供理论依据及数据支持。

1 资料与方法

1.1 真武汤活性化合物成分的筛选及作用靶点 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)依次检索真武汤中的5味中药(附子、茯苓、白术、生姜、白芍)，并设置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug-likeness，DL)≥0.18[7]，筛选出化学性质稳定且药代动力学良好的化合物，作为真武汤的有效成分。并通过TCMSP和Swiss Target Prediction对有效成分进行靶点预测。最后利用UniProt数据库(https：//www.uniprot.org/)中的Retrieve/ID mapping将收集的靶点蛋白统一转换成基因名。

1.2 扩张型心肌病的作用靶点及潜在靶点的获取 分别检索在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM，online mendelian inheritance in man，https：//www.omim.org/)、基因名片数据库(GeneCard，http：//www.genecards.org/)、TTD数据库(therapeutic target database，http：//db.idrblab.net/ttd/)、毒性与基因比较数据库(CTD，the comparative toxicogenomics database，http：//ctdbase.org/)、遗传药理学和药物基因组学数据库(PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org/)获取扩张型心肌病的相关基因，设置关键词为“dilated cardiomyopathy”，将检索获取的靶点整理去重，得到的靶点即为扩张型心肌病相关靶点。将真武汤有效成分靶点和扩张型心肌病的靶点上传至Venn平台(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制韦恩图，并保存取交集的基因，即为真武汤治疗扩张型心肌病的潜在靶点。

1.3 蛋白互作网络的构建 将真武汤治疗扩张型心肌病的潜在靶点导入STRING数据库(https：//www.string-db.org/)，选择Multiple proteins，物种限定为“Homo sapiens”，设置置信度“minimum required interaction score”为“high confidence(0.700)”，获取治疗靶点的蛋白相互作用网络。将蛋白互作网络导入Cytoscape 3.8.0进行可视化并分析。

1.4 真武汤中药-潜在化合物-潜在靶点可视化网络的构建 利用真武汤中药、潜在化合物、潜在靶点构建中药-潜在化合物-潜在靶点网络，并将其导入Cytoscape 3.8.0软件进行可视化分析。

1.5 潜在靶点的基因本体(GO)功能注释和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 应用RStudio的ClusterProfiler包对潜在靶点进行GO功能注释及KEGG通路富集分析，并利用RStudio的ggplot2包绘制GO柱状图及KEGG气泡图，最后利用Pathview包进行代谢途径整合和可视化。

1.6 分子对接验证 利用分子对接实验对关键蛋白和化合物的结合活性进行验证，主要步骤包括配体小分子的处理和受体蛋白的准备以及利用AutoDock Vina对潜在化合物成分和关键靶点进行分子对接实验。①配体小分子处理：首先从TCSMP数据库下载潜在化合物成分的3D结构文件，并保存为mol2格式，利用Open Babel为分子结构加氢原子，选择PH7.2、MMFF94力场，进行加电荷和能量最小化，最后利用Autodock Tools将处理过的化合物转化为pdbqt格式文件。②受体蛋白的准备：首先从RCSB蛋白质结构(PDB)数据库(http：//www.rcsb.org/)获取等待对接的靶点蛋白的晶体结构，然后将晶体结构导入软件PyMol 2.4.0，去除溶剂分子和杂质，并将关键靶点蛋白与配体分离，最后利用PyMol插件GetBox确定对接盒子的中心及大小。③利用AutoDock Vina依次将潜在化合物成分与关键靶点蛋白进行分子对接，并获取对接打分，选取负数绝对值最高的潜在化合物与关键靶点蛋白的对接模式，最后利用PyMol对结合模式作结合模式图。

2 结 果

2.1 真武汤活性化合物筛选及作用靶点收集 通过TCMSP数据库依次检索真武汤中5味中药，设置OB≥30%及DL≥0.18后，得到真武汤活性化合物共59种，其中附子含有活性成分21种，茯苓含有活性成分15种，白术含有活性成分7种，生姜含有活性成分5种，白芍含有活性成分13种，β-谷甾醇是白芍和生姜共有的活性成分，谷甾醇是附子和白芍共有的活性成分(见表1)。通过TCMSP及Swiss Target Prediction数据库检索到相应的靶点共259个，其中附子对应的靶点有144个，茯苓对应的靶点有69个，白术对应的靶点有31个，生姜对应的靶点有69个，白芍对应的靶点有111个。

表1 真武汤活性化合物成分

(续表) 真武汤活性化合物成分

2.2 扩张型心肌病的靶点收集及潜在靶点的获取 通过OMIM、GeneCards、TTD、CTD、PharmGKB数据库检索扩张型心肌病的相关基因，去重整理后得到扩张型心肌病的靶点共980个。将扩张型心肌病相关靶点与真武汤药物相关作用靶点分别导入Venn平台得到交集基因47个，这47个交集基因即为真武汤治疗扩张型心肌病的潜在靶点。详见图1。

图1 药物-疾病共有靶点韦恩图

2.3 网络的构建

2.3.1 蛋白互作网络(PPI)的可视化分析 将获取的47个潜在治疗靶点导入STRING数据库获取蛋白互作网络并导入Cytoscape 3.8.0软件绘制蛋白互作网络图(见图2)，节点的大小反映度值的大小，度值排名前11位的节点分别为白细胞介素6(IL6)、肿瘤坏死因子(TNF)、转录激活因子3(STAT3)、表皮生长因子受体(EGFR)、内皮一氧化碳合酶(NOS3)、转录激活因子1(STAT1)、胱天蛋白酶3(CASP3)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、磷脂酰肌醇-3激酶催化亚单位α(PIK3CA)、过氧化物酶增生激活受体(PPARG)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(见表2)，这些靶点在蛋白互作网络中具有重要的地位，可能是真武汤治疗扩张型心肌病的关键靶点。

图2 PPI蛋白互作网络图

表2 真武汤治疗扩张型心肌病的主要作用靶点(度值)

2.3.2 中药-有效成分-治疗靶点的可视化分析 将构建的中药-潜在化合物-潜在靶点导入Cytoscape3.8.0软件中进行可视化处理(见图3)。君药附子对应的化合物有17个，潜在靶点有26个；臣药茯苓和白术对应的化合物有14个，潜在靶点有14个；佐药生姜和白芍对应的化合物有10个，潜在靶点有31个；其中化合物度值排名前7位的分别是山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、6-Demethyldesoline、去甲乌头碱、3β-乙酰氧基苍术酮、芍药新苷(见表3)，这些化合物靶向了较多的扩张型心肌病相关基因，可能是真武汤治疗扩张型心肌病的关键化合物。君药(附子)和佐药(生姜、白芍)，君药(附子)和臣药(茯苓、白术)，臣药(茯苓、白术)和佐药(生姜、白芍)均具有较多重叠靶点，说明真武汤各组药物之间不仅单独发挥治疗作用，还具有相互协同的治疗作用。

图3 真武汤中药-有效成分-潜在靶点网络图

表3 真武汤治疗扩张型心肌病前7位关键化合物

2.4 潜在靶点的GO功能注释和KEGG通路富集分析 应用RStudio的ClusterProfiler包对47个潜在靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。GO富集分析得到生物过程(biology process，BP)共943条、细胞组分(cellular component，CC)共15条和分子功能(molecular function，MF)共40条，每部分排名前10位如图4所示，由图可知其中主要的生物过程是循环系统中的血管病变、血压负调节、血压调节、白细胞和细胞黏附、第二信使介导的信号通路、活性氧代谢过程、血液循环的调节、类固醇激素反应等。KEGG富集分析得到120条信号通路，其中排名前20位的通路如图5所示，主要涉及晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路(见图6)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、弓形虫病、脂肪细胞脂解调节、肾素分泌、钙信号通路等信号通路。

图4 GO富集分析

图5 KEGG通路富集分析

图6 AGE-RAGE信号通路图

2.5 分子对接验证 利用AutoDock Vina对筛选出的41个关键化合物与PPI网络中度值排名前5位的关键基因(IL6、NOS3、TNF、EGFR、STAT3)依次进行分子对接验证。其中，关键蛋白的晶体结构信息见表4。

表4 靶蛋白及原配体信息

结合能(affinity)是AutoDock Vina评价小分子与蛋白质结合程度的主要标准，结合能小于0说明配体与受体可以自发结合，且结合能绝对值越大，说明配体与靶蛋白受体结合越稳定，当分值大于 5 时说明分子与靶点有较好的结合活性，分值大于7则说明分子与靶点的结合构型具有强烈的活性[8-9]。本研究分子对接验证表明，有效化合物均能很好地与5个关键基因进行对接，其结合能分值的最大值均大于7(见表5)，对关键残基及其作用力分析后，选取结合能分值最大的化合物与靶点蛋白作结合模式图(见图7)。

表5 分子对接结果

图7 分子对接结合模式图

3 讨 论

真武汤出自张仲景的《伤寒杂病论》，主治脾肾阳虚、水饮内停之证以及太阳病发汗太过、阳虚水泛证。全方由附子为君，温肾阳以化气行水，并可散寒止痛兼暖脾阳以运水湿；茯苓、白术皆为臣，茯苓淡渗利湿，白术健脾燥湿；生姜、白芍为佐，生姜助附子温阳散寒，合茯苓散水，又可和胃降逆止呕，白芍则利小便行水气，兼敛阴舒筋解肌肉瞤动，还可防附子燥热伤阴之弊。

由于扩张型心肌病病因及病情较为复杂，目前尚无特异性治疗方案，故临床上多以对症治疗为主，西医方面主要包括强心、利尿、扩血管治疗，而对于终末期病人主要是采用左室减容术、人工心脏辅助机械泵装置、心脏移植等外科手术治疗[10-11]。沉重的医疗负担及不良反应频发，严重影响扩张型心肌病心力衰竭病人的治疗效果[12]。中医药因其整体观念和辨证论治的特点，其治疗扩张型心肌病具有独特优势，且中西医结合治疗更是在改善预后方面疗效明显[13]，真武汤作为温阳利水的代表方，现代药理学研究表明附子不仅具有明显的强心作用，还可以改善外周及冠状动脉循环[14]；茯苓可以改善慢性心力衰竭大鼠尿潴留和心脏功能，还可以缓解肠道微循环障碍，阻止血小板聚集，避免微血栓形成[15]；白术具有免疫调节及抗炎作用，多作为臣药应用于心血管病的治疗[16]；生姜具有抗氧化、抗炎及抑菌作用[17]；白芍具有抗炎、保肝、镇痛、养血等药理作用[18]。然而以上5味中药整体治疗扩张型心肌病的作用机制尚不明确，因此，本研究借助网络药理学方法，以求更深入地探讨真武汤治疗扩张型心肌病的作用机制。

通过分析中药-化合物-靶点网络可知山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、去甲乌头碱、3β-乙酰氧基苍术酮、芍药新苷是真武汤治疗扩张型心肌病的关键化合物，研究表明，山奈酚具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、增强免疫及保护损伤组织的作用[19]；β-谷甾醇、豆甾醇均属于植物中最常见、最重要的甾醇类成分，其中β-谷甾醇除了抗炎及免疫调节作用，还具有很强的抗遗传毒性及抗氧化活性[20]，而豆甾醇则能显著降低炎性因子的表达，具有良好的抗炎活性[21]；去甲乌头碱是附子主要的强心成分之一，其活性极强，可以增强心肌收缩力，加快心率，增强心脏输出量及心肌耗氧量[22]；苍术酮是白术挥发油中的主要物质之一，其对细胞炎症反应具有显著抑制作用[23]；现代药理学研究证实芍药新苷具有抗炎、免疫调节、镇静、镇痛、耐缺氧、抗氧化、抗心肌缺血、抗血栓作用[24]。

通过PPI网络分析得到度值排名前5位的关键靶点为IL6、TNF、STAT3、EGFR、NOS3。现代研究表明，在病毒性心肌炎的感染早期，IL6通过增加巨噬细胞浸润，降低TNF-α和单核细胞趋化蛋白-1水平，限制病毒复制和调节早期炎症反应，从而减轻心肌损伤，但随着炎症持续蔓延，IL6过度表达则可加重心肌损害[25]。STAT3作为激酶信号转导和转录激活因子家族的重要成员，对扩张型心肌病病程发展具有保护作用，有研究表明在用呋喃唑酮构建大鼠扩张型心肌病的模型中，由于钙网蛋白表达，下调STAT3通路的磷酸化，因而导致了显著心肌变性、间质纤维化和线粒体肿胀[26]。EGFR是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的重要跨膜受体，EGFR通路的激活能够促使心肌肥大、炎症及纤维化的发生，最终发展为心力衰竭[27]。NOS3是一种内皮源性一氧化氮，其在调节血管壁功能和心血管稳态方面起着关键作用，心肌NOS表达的研究表明，扩张型心肌病终末期心力衰竭病人中NOS3表达上调[28]，可通过限制钙离子内流对心肌有一定的保护作用，从而预防心律失常和心肌肥厚的发生[29]。上述靶点在PPI互作网络中具有重要地位，在扩张型心肌病的发生发展中具有重要作用，因此，本研究推测真武汤可能是通过山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、去甲乌头碱、3β-乙酰氧基苍术酮、芍药新苷等关键成分作用于上述5种关键靶点从而实现治疗作用。

通过KEGG通路富集分析得到真武汤治疗扩张型心肌病主要涉及AGE-RAGE 、HIF-1、弓形虫、脂肪细胞脂解、肾素分泌、钙离子等信号通路。晚期糖基化终产物受体RAGE是一种多配体的膜受体，与不同配体结合后可以启动多条信号通路，引起细胞内氧化应激和炎症反应，破坏细胞膜蛋白功能，引起钙离子内流，从而导致细胞结构、功能及代谢的异常，甚至细胞凋亡[30]。研究表明，晚期糖基化终产物AGE及其细胞受体RAGE相互作用对心脏功能障碍和糖尿病性心肌病的发作至关重要[31]。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对机体内氧稳态平衡的调节起到维持作用，促使机体对缺氧产生代偿适应。心力衰竭病人的心肌处于缺氧状态，HIF-1α的表达增加，可通过调节血管内皮生长因子等促进新血管形成，增加低氧局部的血流量来增加氧供，以及参与葡萄糖的摄取和糖酵解，在低氧状态下改善心肌细胞的能量代谢；此外，HIF-1α还能介导一氧化氮合酶、肾上腺素受体等参与血管张力的调节，发挥扩血管作用，从而实现心肌保护[32-34]。但也有研究表明，过度、持续地激活HIF-1α会导致心肌肥厚，降低心脏病病人的心功能，甚至加重心肌病的发生[35]。感染也被认为是扩张型心肌病的重要病因之一，其中柯萨奇B病毒、弓形虫和其他某些病毒感染是主要的病因。有研究表明弓形虫在免疫系统受损的病人中存在一种特殊的感染形式，该类病人通常在数年前就已获得感染，其中缓殖子在组织囊肿中一直处于休眠状态，直到免疫抑制再次激活感染，最终发展成为心肌病及心力衰竭[35-36]。

综上所述，本研究通过网络药理学及分子对接技术，初步探讨了真武汤治疗扩张型心肌病的多靶点、多通路的作用机制。真武汤可能通过β-谷甾醇、山奈酚、3β-乙酰氧基苍术酮、去甲乌头碱、芍药新苷等关键活性成分作用于IL6、TNF、STAT3、EGFR、NOS3等关键靶点，通过调节AGE-RAGE 、HIF-1、弓形虫、脂肪细胞脂解、肾素分泌、钙离子等信号通路，产生抑制氧化应激及炎症、改善心肌能量代谢、调节免疫功能等机制发挥综合治疗作用。但本研究同时也存在一定的局限性，如由于数据库的限制及算法的差异，得出的结论不免有所偏差，因此，尚需进一步动物实验或临床验证。