半枝莲-白花蛇舌草药配伍对乳腺癌肺转移及细胞增殖的影响研究

周玮玮，潘博，唐蔚，任迪莎

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006）

“乳岩”是乳腺癌的中医称谓，最早关于此病的记载可追溯至东晋年间[1]，但是古中医并没有乳腺癌肺转移相关概念，在相关古籍中转移核心在于“余毒”“伏邪”等。乳腺癌患者经一系列治疗后正气亏损，既往潜伏的热毒等乘机入络，致使气血失衡、气滞血瘀、热蕴毒结、难以消散，最终累及其他部位出现转移及复发[2]。现代医学则认为乳腺癌的肺转移与肿瘤细胞自激注入存在关联，白介素-6（IL-6）、基质金属蛋白酶 1（MMP1）和趋化因子CXC基序配体1（CXCL1）表达情况与自激注入强度相关[3]；半枝莲与白花蛇舌草抗肿瘤功效已经得到临床认证，本文旨在探讨上述中药配伍后对乳腺癌肺转移的影响及抑制肿瘤细胞增殖效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所需的大鼠均从上海中科院动物实验室购买，且均为雄性大鼠，级别为SPF级，屏障系统内饲养，体质量（125.31±10.02）g，获得实验动物使用许可相关证明。所用的仪器包括酶联免疫检测分析仪、流式细胞仪、荧光显微镜、安全生物柜、细胞培养箱等，试剂包含DMEM培养基、胎牛血清、四甲基偶氮唑盐（MTT）等。

1.2 方法

依计划，观察1组细胞培养物滴入半枝莲、白花蛇舌草药对混合液，观察2组单独应用半枝莲，对照组滴入无菌生理盐水。

肺转移细胞株检测[4]：选取上海中科院生产的人高转移性乳腺癌细胞株（MDA231-LM2细胞），在安全生物柜内完成所有操作。DMEM培养基中加入1%浓度青霉素、链霉素双抗及10%的胎牛血清，将细胞株置入细胞培养液中，于5% CO2+37℃的环境下恒温培养。同时制作含药血清，按人鼠等效剂量标准分别换算出大鼠对半枝莲单独用药剂量及半枝莲-白花蛇舌草合用时剂量，即观察1组、观察2组，煎水后连灌3 d；对照组大鼠连灌3 d生理盐水，3 d后制取大鼠含药血清。取Invitrogen公司生产的合成引物及其序列表，将培养后的MDA231-LM2细胞进行重悬，截取出6×105数量的细胞置入圆皿中，加入含药血清，浓度控制在10%，混合物放于5% CO2、37℃环境下24h，弃上清后加入Trizol，使得细胞完全充分裂解。逆转录总RNA，扩增PCR后提取mRNA并逆转录，制定反应体系，配制反应液，PCR反应后采集荧光信号，记录IL-6、MMP1 和CXCL1表达情况。

细胞增殖检测[5]：选择上海中科院生产的人乳腺癌细胞MDA-MB-231进行研究，将量为1×105/ml处于对数生长期的细胞接种至孔板中，共96孔，每孔细胞数量为100 μl，培养箱内放置24 h后分别加入半枝莲溶液、半枝莲-白花蛇舌草溶液及生理盐水，即观察2组、观察1组及对照组，每孔再加入MTT溶液10 μl，完成4 h的孵育，弃去上清，再加入DMSO 150 μl，振荡后以酶联免疫法检测波长570 nm的吸收值，抑制率计算公式=（1-观察组均值/对照组均值）×100%。

1.3 观察指标

以肺转移细胞株mRNA上转移因子及肿瘤细胞570 nm吸收值作为观察项目，前者指标包括IL-6、MMP1及CXCL1；后者为用药不同时间段细胞吸收值的比较。

1.4 统计学分析

数据均录入SPSS 25.0软件进行处理，计量资料以（均数±标准差）表达，行t检验，检验水准为0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠细胞株中肿瘤转移相关因子水平比较

观察组各组mRNA中IL-6、CXCL1、MMP1水平均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），且观察1组上述指标水平则低于观察2组（P<0.05），见表1。

表1 两组肿瘤转移因子比较

2.2 各组不同时间细胞波长吸收值比较

观察1组、2组细胞各时段570nm细胞吸收值均小于对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）；且观察1组12h、24h及48h吸收值明显小于观察2组（P<0.05），观察1组抑制率明显高于观察2组，且随着时间推移、抑制率更高。见表2。

表2 各组不同时间细胞波长吸收值比较

3 讨论

3.1 乳腺癌肿瘤细胞肺转移与IL-6、CXCL1、IL-8、MMP1的关系

肺与骨是乳腺癌转移较常发生的两个部位，有资料统计[6-7]，肺转移后患者中位生存期可缩短至25个月。肿瘤细胞侵袭肺部后可造成肺组织损伤及功能受损，可表现为咯血、胸闷、胸痛等，严重影响患者生存质量。且相关研究发现[8-9]，乳腺癌手术后发生远处转移及原位复发与自激注入有关，位于原发肿瘤的循环肿瘤细胞自原位脱落随血液或淋巴循环种植在其他器官活组织并且能返回至原发位置继续刺激肿瘤发展，因此乳腺癌的肺转移与循环肿瘤细胞密切相关。在肿瘤的自激注入过程中，乳腺癌肿瘤细胞以信号释放方式诱导循环肿瘤细胞穿过组织黏膜内皮定植，后者会促使机体生成新生血管、炎性细胞活化相关调控因子[10]，进一步加快肿瘤的生长。与循环肿瘤细胞、自激注入有关的基因因子包括IL-6、CXCL1、IL-8、MMP1等，其中IL-6能对循环肿瘤细胞中侵袭性强的细胞产生吸引作用，CXCL1、MMP1则能调节循环肿瘤细胞的侵袭能力及局部浸润能力，故本实验将IL-6、CXCL1、MMP1作为乳腺癌肿瘤细胞肺转移风险指标，分析其临床意义。

3.2 半枝莲-白花蛇舌草药配伍对乳腺癌肺转移肿瘤转移相关因子水平的影响

本研究中观察组各组mRNA中IL-6、CXCL1、MMP1水平均低于对照组，且观察1组上述指标水平则低于观察2组（P<0.05），说明IL-6、CXCL1、MMP1水平与乳腺癌肿瘤细胞肺转移有关，且不用中医治疗方案对肿瘤转移相关因子水平的影响不一。

中药是现代中医重要组成部分，半枝莲、白花蛇舌草在肿瘤治疗方面优势多有报道[11]，乳腺癌在中医称为“乳岩”，发生肺转移的证型多为热毒蕴结证，而半枝莲清热解毒、化瘀利尿，白花蛇舌草亦能清热解毒、利湿通淋；从分子药理学角度而言，半枝莲对于肿瘤细胞活化相关因子有较好抑制效果，白花蛇舌草则能推动肿瘤细胞的代谢与凋亡，故表1提示相较于空白对照组，半枝莲单独用药（观察2组）及与白花蛇舌草联合用药（观察1组）均能极大地降低高转移细胞株mRNA上各因子表达，对乳腺癌肺转移有一定抑制能力。药对是中医中最小组方的复方中药，既可保存单味中药的药理特性，又能以组药形式相互促进、增加药理层次，提高药物疗效，表1中观察1组以药对方式用药后对各促转移因子控制效果更好，提示半枝莲-白花蛇舌草能抑制乳腺癌细胞自激注入能力，降低转移概率。

3.3 半枝莲-白花蛇舌草对乳腺癌细胞增殖的影响

药理研究显示，半枝莲提取物能抑制β-连环蛋白活化进程，抑制MMP1表达水平及转录因子，对肿瘤细胞有丝分裂起阻滞作用，进而控制细胞增殖速度、减缓肿瘤生长速度、抑制循环肿瘤细胞活化、促进肿瘤细胞凋亡[12]。白花蛇舌草提取物除能抑制MMP1外，还能抑制与之相关的MMP2、MMP9，同时对血管生成活化通路形成抑制，加快细胞凋亡进程[13]。半枝莲、白花蛇舌草均能减缓肿瘤细胞的复制进程，控制肿瘤区域新生血管的生成，进一步减少肿瘤组织血液供应，因此对减缓异常细胞增殖有积极作用，且阮祥美等[14]的研究亦认为半枝莲-白花蛇舌草是中医治疗乳腺癌的核心药对，表2显示，随着用药时间得延长，半枝莲、白花蛇舌草对乳腺癌细胞的抑制率逐级提升，且药对用药时控制细胞增殖效果更佳。

综上所述，乳腺癌采取百枝莲-白花蛇舌草配伍为药对后治疗能通过控制肿瘤细胞分化及肿瘤循环细胞活性，阻碍肿瘤细胞分化、复制进程，降低肺转移风险，并可有效抑制细胞增殖速度，临床治疗时可考虑此方面用药，但仍需进行充分的临床用药研究，以获得更多的人体用药数据。